董宏偉,鄭 豐,李永彬

(河南省駐馬店市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 駐馬店 463000)

H9N2亞型禽流感病毒屬于低致病性禽流感病毒(LPAIV)，最早于1966年從患輕度呼吸道疾病的火雞上分離得到，被命名為A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)[1]。近年來(lái)，H9N2亞型禽流感的流行變得日益頻繁，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，有效防治禽流感仍是一個(gè)亟待解決的難題。目前，控制禽流感的措施主要依賴于疫苗和抗病毒藥。病毒抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)換帶來(lái)的病毒持續(xù)變異，使AIV可逃逸動(dòng)物機(jī)體已有的免疫應(yīng)答，流感疫苗僅對(duì)亞型內(nèi)抗原匹配較好的毒株具有免疫保護(hù)作用，往往對(duì)下一次的疫情起不到保護(hù)作用，難以應(yīng)對(duì)流感大流行；流感病毒對(duì)抗病毒藥物極易產(chǎn)生耐藥性。

維生素在調(diào)節(jié)免疫過(guò)程中有廣泛且重要的作用，比如淋巴細(xì)胞活化和增殖，輔助性T細(xì)胞的分化、組織特異性淋巴細(xì)胞歸巢，特異性抗體產(chǎn)生和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。VC、VE和B族維生素作為抗氧化劑，以非特異性的方式發(fā)揮免疫作用；而VA和VD有激素樣特性，通過(guò)與核激素受體的相互作用，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其代謝物在調(diào)節(jié)組織特異性免疫反應(yīng)、預(yù)防或治療炎癥方面有一定潛力[2]?；诖?，本試驗(yàn)采用高、中、低3個(gè)不同濃度的復(fù)合維生素給小鼠灌服，通過(guò)觀察小鼠臨床癥狀、存活狀況、體溫、體重和采食量的變化，以確定復(fù)合維生素給藥劑量，從而增強(qiáng)對(duì)AIV的抵抗力，為H9N2亞型禽流感的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

手提式壓力蒸汽滅菌器(YX-280D)(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司)， 電熱恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)， 超低溫冰箱(上海精天電子儀器有限公司)， 垂直流超凈工作臺(tái)(上海智成分析儀器制造有限公司)，電子天平(上海第二天平儀器廠) 。

1.2 病毒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

A/Chicken/HB/4/2008(H9N2) EID50為10-8.78/0.2mL本課題組分離、保存。6-8周齡雄性SPF BALB/c系小鼠(購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。

1.3 藥品

Retinyl acetate(批號(hào)1001019413，Sigma公司)，維生素C注射液(批號(hào) H20046089，辰欣藥業(yè)股份有限公司)，維生素D2果糖酸鈣注射液(批號(hào) H44024177，天心制藥有限公司)，(±)-α-Tocopherol(批號(hào)1001006848，Sigma公司)。

1.4 主要試劑的配制

生理鹽水NaCl0.85g，去離子水100mL，完全溶解，高壓滅菌。

0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O3.63g，KH2PO40.24g，去離子水900mL用鹽酸調(diào)pH值至7.4，加去離子水定容至1000mL，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1萬(wàn)U/mL雙抗液注射用青霉素80萬(wàn)單位，注射用鏈霉素80萬(wàn)單位，PBS80mL，完全溶解后，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 觀察不同劑量復(fù)合維生素對(duì)小鼠臨床癥狀和存活率的影響

表1 不同組復(fù)合維生素的組分劑量

取6-8周齡18-20 g雄性SPF BALB/c系小鼠30只隨機(jī)分為4組，按常規(guī)方法飼養(yǎng)。各組維生素劑量見(jiàn)表1。設(shè)置對(duì)照組，每天給小鼠灌胃復(fù)合維生素液或生理鹽水200 μL，連續(xù)灌胃10 d，11 d時(shí)鼻腔接種A/Chicken/HB/4/2008(H9N2)病毒的感染性雞胚尿囊液200 μL/只，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)和死亡情況并作好記錄，連續(xù)觀察31 d。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以(X±SE)表示。用SPSS for Windows 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)(Independent samplettest),P<0.05判為差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 復(fù)合維生素對(duì)H9N2亞型禽流感病毒感染小鼠臨床癥狀和存活狀況的影響

攻毒組小鼠，在攻毒后第1天整體狀態(tài)良好；攻毒后第2天開(kāi)始出現(xiàn)精神沉郁，活動(dòng)減少，扎堆，體溫、體重和采食量均大幅下降；攻毒后第3天癥狀比較明顯，大部分小鼠精神高度沉郁，不活動(dòng)或活動(dòng)緩慢，被毛粗亂無(wú)光澤，呼吸呈弓背呼吸，出現(xiàn)呼吸震顫音，表現(xiàn)出呼吸困難和呼吸窘迫等典型流感癥狀(圖1A)，嚴(yán)重的呼吸窘迫持續(xù)3 d，存活小鼠從攻毒后第7天體征逐步恢復(fù)，第14天基本恢復(fù)至正常水平。維生素組也出現(xiàn)上述癥狀，但是癥狀較輕且高劑量維生素組癥狀最輕，恢復(fù)更早(圖1B)。

圖1 感染H9N2后第6天小鼠臨床表現(xiàn)變化

存活率：感染后4-6 d為小鼠死亡高峰期，攻毒組在感染后開(kāi)始死亡，觀察期內(nèi)攻毒組與維生素組存活率均為33%(6/18),對(duì)照組小鼠存活率為100%(圖2)。維生素組小鼠開(kāi)始死亡時(shí)間為144 h，比攻毒組小鼠110 h推遲了34 h，說(shuō)明4種復(fù)合維生素對(duì)小鼠有一定的保護(hù)作用。

圖2 維生素組以及對(duì)照組小鼠的存活曲線

2.2 不同劑量復(fù)合維生素對(duì)小鼠體溫、體重等臨床癥狀的影響

灌胃期間各組體溫穩(wěn)定，維持在37-38 ℃之間，接種病毒后，除對(duì)照組體溫穩(wěn)定，其余各組體溫均呈現(xiàn)先下降后上升態(tài)勢(shì)，攻毒組與各維生素組體溫均在接種后第2天下降，攻毒組、低劑量維生素組和中劑量維生素組分別在第5、6、8天達(dá)到最低，高劑量給藥組第2天達(dá)到最低，但最低值明顯高于攻毒組，隨后，各組恢復(fù)期間體溫緩慢回升(圖3)。

圖3 維生素組以及對(duì)照組小鼠體溫變化情況

對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間體重緩慢上升，高劑量維生素組、中劑量維生素組、低劑量維生素組和攻毒組分別在攻毒后第3、7、8天下降至最低，高劑量維生素組明顯高于對(duì)照組，且體重降低7%，明顯低于其他組22%～30%。之后各組體重不斷恢復(fù)，高劑量和中劑量維生素組體重始終高于攻毒組(圖4)。

圖4 維生素組以及對(duì)照組小鼠體重變化情況

接種病毒第2天，除對(duì)照組，其余各組采食量下降(圖5)，第3天均降至最低點(diǎn)，下降和恢復(fù)期間，各組采食情況為：高劑量維生素組>中劑量維生素組>攻毒對(duì)照組>低劑量維生素組。

綜合各組臨床癥狀、存活狀況、體溫、體重和采食量的情況，高劑量維生素組和中劑量維生素組對(duì)H9N2亞型流感病毒起到一定保護(hù)作用，前者保護(hù)作用更好。

3 討論

H9N2亞型禽流感病，于1966年首次從火雞中被檢測(cè)，現(xiàn)在已呈全球流行,其宿主范圍不斷擴(kuò)大，包括人類、狗、豬、雞、鴨、鵪鶉、野雞、鵪鶉、鴿子、烏骨雞、石雞和白鷺等[70]。H9N2亞型禽流感通常不會(huì)引起明顯的臨床癥狀或雞只死亡，表現(xiàn)為輕度的發(fā)病率和死亡率，但是與其他病原菌共感染則會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大損失[4]。此外，H9N2亞型流感病毒已經(jīng)在家禽中建立了穩(wěn)定的種系，在多種宿主中流行并持續(xù)變異，如H6N1，H6N2、H5N1、H7N9和H10N8，可能產(chǎn)生感染人類的重組毒株，帶來(lái)公共衛(wèi)生安全隱患[3, 5]。因此，有效防控H9N2對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害和人類公共衛(wèi)生安全具有雙重意義。H9N2亞型禽流感病毒屬低致病性病毒，常表現(xiàn)為隱性感染或僅表現(xiàn)輕微癥狀，未能引起人們足夠重視；由于病毒不斷變異和重組，疫苗保護(hù)效果不斷下降；抗流感藥物如金剛烷胺、金剛乙胺的頻繁使用，已出現(xiàn)耐藥性，對(duì)流感病毒的敏感性也越來(lái)越低。因此，需要繼續(xù)尋求有效的防控H9N2亞型禽流感的方法。

維生素是人和動(dòng)物必須從食物中獲得的一類微量有機(jī)物質(zhì)，在機(jī)體生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究顯示，不同維生素在麻疹、艾滋病、流感的預(yù)防或治療上有一定作用。本實(shí)驗(yàn)采用高、中、低3個(gè)不同濃度的四種復(fù)合維生素給小鼠灌服，觀察其對(duì)H9N2亞型禽流感病毒感染小鼠的保護(hù)效果。每天給予800 IU VA、25 mg VC、12 IU VD和3.2 IU VE的高劑量復(fù)合維生素組小鼠感染H9N2亞型禽流感病毒后精神狀態(tài)、體溫和采食量的維持明顯好于其他組，尤其在體重方面，感染后體重降低7%，明顯低于其他組22%～30%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量復(fù)合維生素對(duì)H9N2亞型禽流感感染的小鼠能起到保護(hù)作用。