文/王 軍 吳達雄 林少寶 郭 健 楊曉泉 許嘉偉 黎恒希

（1 廣州風行乳業(yè)股份有限公司；2 華南理工大學食品科學與工程學院）

隨著生活水平的提高，人們越來越注重飲食的營養(yǎng)與健康，不論消費者還是食品行業(yè)從業(yè)人員，對于蛋白質的認識不僅僅滿足于裹腹所需，如今已轉變?yōu)椤敖∩?、塑身、解決饑餓、保持骨骼和肌膚健康”這樣一個更全面、更科學的概念[1，2]。

酸奶由于口感獨特、品類豐富多樣以及營養(yǎng)健康等特點，受到了眾多消費者的青睞。據報道，酸奶可以減少慢性疾病如肥胖癥、Ⅱ型糖尿病和心血管疾病的發(fā)病率，并且會對腸道微生物產生有益影響[3～6]。追求健康成為驅動消費者購買酸奶的重要因素之一。在中國，酸奶呈現(xiàn)出非常強勁的發(fā)展態(tài)勢，新品占比從2012年的不到20%，增長至2016年的近30%，特別是2015～2016年的增長率近50%。酸奶發(fā)展的一個關鍵趨勢是增加蛋白質含量，消費者追求蛋白質含量的潮流帶動了希臘酸奶和冰島酸奶的火熱發(fā)展，各大品牌也相繼推出各式各樣的高蛋白酸奶。近幾年，全球酸奶市場上出現(xiàn)了很多植物基酸奶，植物酸奶的蛋白質來源越來越多樣化，這也將是乳品企業(yè)發(fā)展的機會點之一。因此，將經過剪切及熱處理制得的具有惰性表面、弱成膠性能及微米尺度的微?；鞍譡7，8]添加到酸奶體系中，在提高蛋白質含量的同時賦予酸奶細膩、嫩滑的口感，具有重要的研究意義。

葡萄糖酸-δ-內酯（glucono-delta-lactone，GDL）在食品中常被用作酸化劑，易溶于水并在水溶液中緩慢水解產生葡萄糖酸，導致溶液pH值緩慢降低。當GDL存在于蛋白質分散液中，隨著GDL不斷水解，體系pH值向蛋白質等電點靠近，蛋白質分子表面的電荷也隨之減少。在分子間斥力降低的情況下，蛋白質彼此靠近并發(fā)生聚集；隨著pH值進一步降低，蛋白質的聚集程度提高并最終形成凝膠[9，10]。本文以大宗農產品副產物——大豆分離蛋白（SPI）為原料，采用GDL酸化模擬酸奶的發(fā)酵過程，以此研究微粒化蛋白對蛋白質凝膠形成過程和凝膠微觀結構的影響，探討將微粒化蛋白應用于植物基酸奶食品體系中的可能性。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

低溫脫脂大豆粕；微?；榍宓鞍?；葡萄糖酸-δ-內酯（GDL）；異硫氰酸熒光素酯（Fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC）；氫氧化鈉、鹽酸，均為分析純；實驗用水均為去離子水。

1．2 試驗儀器

頂置式攪拌器RW20（德國IKA公司）；分散均質機T25（德國IKA公司）；高壓微射流均質機（美國MFIC公司）；旋轉流變儀RheoStress 600（美國Thermo Fisher公司）；萬能材料試驗機5943（美國INSTRON公司）；紫外分光光度計Genesys 10 s（美國Thermo Fisher公司）；臺式掃描電子顯微鏡TM 3000（日本Hitachi公司）；倒置生物顯微鏡IX53（日本Olympus公司）。

1．3 大豆分離蛋白（SPI）的制備

將低溫脫脂大豆粕粉碎后過60 目篩，得到的粉末以1∶10（質量/體積）的比例與去離子水混合。以2 N（克當量，下同）氫氧化鈉調節(jié)pH值至8.0，室溫下攪拌2 h，8 000 r/min離心20 min。取上清液，以2 N鹽酸調pH值至4.5，隨后再次8 000 r/min離心20 min。取沉淀復溶于水中，回調pH值至7.0，置于去離子水中透析48 h后冷凍干燥，獲得大豆分離蛋白（SPI）。

1．4 酸誘導蛋白凝膠的制備

將SPI和微?；榍宓鞍追謩e用去離子水配制成分散液，調節(jié)pH值為7.0，將兩者按不同的比例混合（樣品中總蛋白質含量為10%），然后在90 ℃水浴中靜置20 min，冷卻至室溫后加入GDL溶液（終濃度為100 mg/g蛋白質），輕微攪拌混合均勻后放置在40 ℃水浴中使其形成凝膠。

1．5 凝膠的流變學特性分析

取1 mL加入了GDL的蛋白質分散液置于旋轉流變儀樣品臺上，選用平行板（直徑為35 mm）進行測試，記錄樣品在酸化成膠過程中彈性模量G'及黏性模量G''的變化（頻率為1 Hz，應變?yōu)?%），隨后對樣品進行頻率掃描（0.1～100 Hz，應變?yōu)?%）和應變掃描（頻率為1 Hz）。

1．6 凝膠的機械特性分析

采用萬能材料試驗機對蛋白凝膠進行壓縮測試。將酸化制得的凝膠切成直徑5 mm、高10 mm的圓柱體，選用直徑為25 mm的探頭，測試前、后速度均為1 mm/s，測試速度為0.2 mm/s，凝膠壓縮程度為80%，觸發(fā)力0.1 g。Hencky應變（∈h）和應力（σ）分別根據式（1）和（2）計算，斷裂應變（εf）和斷裂應力（σf）是應力-應變曲線的最高峰點，楊氏模量是應力-應變曲線中初始線性區(qū)域的斜率，通過線性回歸得到，用來反映凝膠的剛性。式中h0和A0分別是測試凝膠的原始高度和面積；h（t）和F（t）是凝膠在t時間的高度和受到的力。

1．7 凝膠的微觀形貌觀察

把制備好的凝膠用2.5%戊二醛溶液（含20 mmol/L pH值7.0的磷酸鹽緩沖液）固定過夜，磷酸鹽緩沖液漂洗3 次后，用不同濃度的乙醇對凝膠進行梯度脫水（30%～100%，每個濃度乙醇均停留10 min），在通風櫥風干后切片，用導電雙面膠固定在樣品臺上，使用離子濺射儀對其表面進行噴金處理（噴金時電流設置為20 mA，時間為45 s），然后將樣品放入樣品室，以15 kV電壓進行觀察并拍照。

1．8 凝膠的持水性分析

準確稱取1.0 g加入了GDL的蛋白質分散液，置于2 mL離心管中，靜置6 h等待其成膠，4 000 r/min離心20 min，用濾紙小心吸干凝膠表面水分，通過凝膠離心前后的質量差異計算得出凝膠持水性（WHC），見式（3），其中M1為凝膠離心前的質量，M2為凝膠離心后的質量。

2 結果與討論

2．1 酸化誘導成膠的流變學特性分析

食品的流變學特性在很大程度上決定其口感，并影響消費者對于食品的可接受程度[11，12]。本文將微粒化蛋白替代部分SPI制備GDL誘導的蛋白凝膠（蛋白質總濃度為10%，其中微?；鞍追謩e占0%、2%、4%、6%、8%和10%）。酸化誘導蛋白凝膠的外觀圖片（圖1）直觀地表明凝膠隨著微粒化蛋白替代量的增加而逐漸被弱化。當微粒化蛋白的添加量為8%時，凝膠呈現(xiàn)軟塌不堅實狀態(tài)，已經不能保持自支持圓柱體形狀，當微粒化蛋白的添加量為10%時，蛋白質分散液經GDL誘導后仍具有流動性，不形成凝膠。

圖1 以不同微?；鞍滋娲频盟峄疭PI凝膠的外觀

圖2 酸化誘導SPI/微?；鞍左w系的成膠動力學分析

圖3 酸化誘導SPI/微?；鞍左w系的頻率掃描分析

為此，本文選取微粒化蛋白替代量為0%～6%的復合蛋白質樣品，觀察其成膠動力學過程（圖2），結果顯示，各體系的模量在酸化過程中均呈上升趨勢；隨著微?；鞍滋娲吭黾樱罱K所成凝膠的彈性模量和黏性模量則呈顯著下降趨勢；而只含有微?；鞍椎捏w系在GDL酸化過程中，體系的彈性模量和黏性模量都沒有超過10 Pa，未能形成凝膠。凝膠的頻率掃描結果（圖3）顯示，當微粒添加量為0%和2%時，凝膠表現(xiàn)出較弱的頻率依賴性，具有較高的凝膠強度；隨著微?；鞍滋娲吭黾樱Ａ拷档颓翌l率依賴性下降，凝膠減弱至不形成凝膠。這表明，微?；鞍椎募尤朊黠@弱化凝膠的強度，且隨著替代程度提高，凝膠的強度降低。

在凝膠的線性黏彈區(qū)域內，彈性模量與應變無關，不隨應變而變化，超出這個區(qū)域是凝膠的非線性黏彈區(qū)域，凝膠的彈性模量隨應變增大而呈下降趨勢。凝膠的彈性行為是由其網絡結構決定的，GDL誘導蛋白凝膠的應變掃描（圖4）顯示，不同微?；鞍滋娲恐苽涞哪z具有不同的線性黏彈區(qū)域；隨著微?；鞍滋娲吭黾樱z的彈性變弱；在同樣外力作用下，由微?；鞍撞糠痔娲鶶PI形成的凝膠更容易斷裂。因此，可以通過添加不同量的微粒化蛋白達到調控蛋白凝膠組織結構的目的，從而開發(fā)出易被大眾接受的食品或滿足特定人群的口感需求。

2．2 酸化誘導蛋白凝膠的機械性能

為了考察GDL酸化誘導蛋白凝膠的機械特性，對以微?；鞍撞糠痔娲鶶PI體系所成凝膠進行單向壓縮測試（圖5）。壓縮曲線出現(xiàn)的第1個峰值稱為屈服極限點，表示承受外力到一定程度時，其變形不再與外力成正比而產生明顯的塑性變形，當外力繼續(xù)增大到材料破壞時的應力，稱為材料的強度極限。屈服極限和強度極限分別表示材料抵抗破壞和抵抗塑性變形的能力，楊氏模量用以表示凝膠的剛性。

表1結果顯示，隨著微?；鞍滋娲吭黾?，凝膠的斷裂應變從0.87降低至0.58，斷裂應力從13.62 kPa降低至3.9 kPa，說明加入微?；鞍缀?，蛋白凝膠抵抗破壞和抵抗塑性變形的能力下降，即在外力作用下，凝膠結構容易被破壞。此外，凝膠的楊氏模量也從26.58 kPa降低至10.92 kPa，表明蛋白凝膠的剛性也出現(xiàn)很大程度的降低。

表1 酸化誘導SPI/微粒化蛋白體系所成凝膠的機械特性

圖4 酸化誘導SPI/微?；鞍左w系的應變掃描分析

圖5 酸化誘導SPI/微?；鞍左w系所成凝膠的應力-應變曲線

流變學分析及機械性能的數(shù)據均表明，微?；鞍椎募尤肟娠@著弱化大豆蛋白在酸化過程中形成的凝膠網絡。這是由于微粒化蛋白經剪切處理后，其疏水基團內卷，表面用于蛋白質聚集的位點減少；將其加入至SPI體系后，阻礙了大豆蛋白聚集體間形成相互作用，進而影響了所成的三維網絡結構。壓縮測試進一步證明加入微?；鞍缀?，蛋白凝膠變得容易被咀嚼，微?；鞍卓捎糜谡{控蛋白質基食品的質構。

圖6 酸化誘導SPI/微粒化蛋白體系所成凝膠的持水性分析

2．3 酸化誘導蛋白凝膠的持水性分析

圖6結果顯示，加入微粒化蛋白不僅能弱化凝膠強度，也對凝膠的持水性有所影響。隨著微?；鞍滋娲繌?%提高至6%，凝膠持水性從47%下降至28%。持水性對于酸奶及凝膠類食品的保藏品質、口感等均有較大影響。微粒化蛋白雖然可以在提高產品蛋白質含量的同時弱化體系的機械強度，提供良好口感，但也會對產品的持水性產生不利影響。

2．4 酸化誘導蛋白凝膠的微觀形貌觀察

圖7 酸化誘導SPI/微?；鞍左w系所成凝膠的掃描電鏡圖片

圖8 微粒化蛋白在酸化過程中微觀形貌變化

凝膠的網絡強度及持水性與其微觀結構緊密相關。為此，本文將凝膠用戊二醛固定干燥后利用掃描電鏡觀察其微結構（圖7）。當沒有添加微?；鞍讜r，GDL誘導形成SPI凝膠的網絡結構致密而規(guī)則有序，因而具有相對較強的機械性能；在此有序的結構中，水分可被束縛在其致密的空間網絡內部，不易流失，因而該凝膠的持水性較好。添加微?；鞍椎哪z網絡結構則呈現(xiàn)不一樣的狀態(tài)，致密的網絡結構消失，球狀顆粒清晰可見，鑲嵌于SPI所成網絡之中。隨著微粒化蛋白添加量的增加，在凝膠中可以觀察到的微粒數(shù)量也隨之增加。微?；鞍自谀z中仍以微粒形式存在，不與其他微?；虻鞍踪|發(fā)生交聯(lián)作用，表明微?；鞍卓梢宰鳛楦叩鞍资称分械慕Y構破碎塊，破壞SPI所成的凝膠網絡。同時，隨著微?；鞍椎募尤?，大豆蛋白凝膠內部規(guī)則有序的網絡結構被破壞，結構疏松，孔隙增大，凝膠強度降低的同時，截留水分子的能力也降低。

蛋白質冷致凝膠網絡的形成是一個逐漸完善的過程，在GDL酸化過程中，由于靜電斥力減小，大豆蛋白彼此靠近并發(fā)生聚集，最終形成相互連接的凝膠網絡。為了探究蛋白質微粒在凝膠形成過程中的作用，本文以FITC標記微?；鞍?，采用熒光顯微鏡記錄微?；鞍自谒峄^程中的微觀形貌變化（圖8）。在4 h的酸化過程中，體系pH值從7.12逐漸下降至5.27，且酸化速度逐漸降低。圖8顯示，微?；鞍椎男蚊苍诖诉^程中沒有發(fā)生明顯變化，一直保持完整的球狀外觀，顆粒尺度也沒有顯著增加；顆粒彼此之間也沒有發(fā)生聚集或交聯(lián)，表明微?；鞍自谀z形成過程中獨立存在，結構穩(wěn)定。因此，微?；鞍卓梢宰鳛榱己玫亩栊蕴畛洳牧蠎糜谒崮淌称敷w系中，并起到弱化凝膠網絡的作用。

3 結論

本文采用GDL酸化來模擬酸奶的發(fā)酵過程，以微?；鞍滋娲糠諷PI，并經過GDL酸化誘導制備凝膠。在此過程中，微?；鞍讻]有發(fā)生顯著變化，仍然保持其球狀外貌，沒有參與大豆蛋白凝膠網絡的形成。酸致凝膠的流變學分析及機械性能測試結果表明，該網絡的強度被顯著弱化，其持水性也有所降低。這表明，微?；鞍卓稍谥参锘崛槭称敷w系中應用，能夠提高產品蛋白質含量的同時，賦予其良好的口感。