文/何 娜

（黑龍江省完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司）

維生素H（Vitamin H）又稱維生素B7、生物素、輔酶R，是一種水溶性含硫維生素，屬于B族維生素[1]。維生素H是合成維生素C的必需物質(zhì)，是脂肪和蛋白質(zhì)代謝不可缺少的物質(zhì)，是維持人體正常功能和自然生長(zhǎng)所必需的水溶性維生素[2]。嬰兒缺乏維生素H會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重后果，因此必須在嬰兒配方奶粉中強(qiáng)化維生素H。

維生素H的測(cè)定方法主要有儀器法、ELISA酶聯(lián)免疫法、微生物法等[3，4]，其中微生物方法最靈敏且應(yīng)用較為廣泛。目前，維生素H的微生物檢測(cè)方法主要是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法和試劑盒方法[5]。本文采用《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物素的測(cè)定》（GB 5009.259-2016）和VitaFast? Vitamin B7（Biotin）試劑盒（R-Biopharm公司生產(chǎn)）對(duì)市售10 份嬰兒配方奶粉中維生素H含量進(jìn)行檢測(cè)比對(duì)研究[6，7]。

1 試劑和材料

1．1 試驗(yàn)樣品

市場(chǎng)在售的含維生素H的嬰兒配方奶粉，10 份。

1．2 試劑和菌種

維生素H標(biāo)準(zhǔn)品（C10H16N2O3S），純度≥9 9%；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，維生素H測(cè)試用培養(yǎng)基；氯化鈉，氫氧化鈉，無(wú)水乙醇，鹽酸，檸檬酸鹽，硫酸；植物乳桿菌Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）；VitaFast?Vitamin B7（Biotin）試劑盒。

1．3 儀器

酶標(biāo)儀，電子天平，全自動(dòng)新型生化培養(yǎng)箱，立式壓力蒸汽滅菌器，離心機(jī)，METTLER綜合測(cè)試儀，722可見分光光度計(jì)。

2 試驗(yàn)方法

2．1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法 [8]

2．1．1 菌種制備

將植物乳桿菌Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）轉(zhuǎn)移到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出后接種到乳桿菌瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使菌株活化，在試驗(yàn)之前連續(xù)接種2～3 代以確保菌株最佳生存力。使用接種環(huán)將活化菌株轉(zhuǎn)移到滅菌的乳桿菌肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。取出后，將菌種懸浮液離心，棄去上清，然后用氯化鈉溶液搖動(dòng)后離心，棄去上清，重復(fù)3 次。最后，用氯化鈉溶液稀釋至透光率為80%。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法

表2 待測(cè)液制作方法

2．1．2 試樣提取

稱量適量樣品至250 mL錐形瓶中，加入100 mL硫酸溶液，121 ℃水解30 min，冷卻后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至（4.5±0.2），隨后轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中并用水定容至刻度。過濾后，取出5 mL濾液，加入20 mL水，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至（6.8±0.2），轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容。

2．1．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取維生素H標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用50%乙醇溶液溶解，轉(zhuǎn)至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度。隨后稀釋為0.2 ng/mL和0.1 ng/mL工作液備用。將水、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和維生素H測(cè)定用培養(yǎng)基按表1順序加入培養(yǎng)管中，3個(gè)平行。

2．1．4 待測(cè)液制作

將水、樣品溶液和維生素H測(cè)定用培養(yǎng)基按表2順序加入培養(yǎng)管中，3 個(gè)平行，每個(gè)樣品都需要有樣品空白管。

2．1．5 接種和培養(yǎng)

所有試管均用小鋼帽覆蓋，置于蒸汽滅菌器中，121 ℃滅菌5 min。滅菌后快速冷卻至室溫，并在無(wú)菌條件下將一滴菌懸液接種到每個(gè)測(cè)定試管中，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管未接種空白，樣品空白不添加菌懸液。隨后37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。

2．1．6 測(cè)定和結(jié)果計(jì)算

將培養(yǎng)的測(cè)定管晃動(dòng)均勻，使用1 cm厚比色皿在550 nm處通過接種空白管將透光率調(diào)節(jié)至100%，然后依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列管和樣品管的透光率。以標(biāo)準(zhǔn)系列管維生素H濃度為橫坐標(biāo)，透光率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中維生素H含量根據(jù)式（1）計(jì)算，式中X為樣品中維生素H含量（μg/100 g）；Cx為樣品試管中維生素H的濃度平均值（ng/mL）；f為樣液稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量（g）。

2．2 試劑盒方法

2．2．1 樣品處理

稱取1 g奶粉樣品放入至50 mL無(wú)菌試管中，加入40 mL無(wú)菌水并搖勻，調(diào)節(jié)pH值至（8.0±0.2），充分混合，在95 ℃水浴中提取30 min，每5 min搖一次，迅速冷卻至室溫[9]。在無(wú)菌條件下，將1 mL樣品通過0.2 μm無(wú)菌濾膜器過濾到2 mL無(wú)菌管中，再根據(jù)樣品中維生素H含量用試劑盒中提供的無(wú)菌水進(jìn)一步稀釋樣品至合適濃度，稀釋后的樣品用于檢測(cè)[10]。

2．2．2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

打開維生素H標(biāo)準(zhǔn)品，在標(biāo)準(zhǔn)品瓶中加入2 mL無(wú)菌水，充分溶解，即配成標(biāo)準(zhǔn)濃縮液，按表3依次將無(wú)菌水和標(biāo)準(zhǔn)濃縮液分別加入到2 mL離心管中。

2．2．3 培養(yǎng)基制備

用鑷子從培養(yǎng)基中取出干燥劑，加入10 mL無(wú)菌水，充分搖勻，95 ℃水浴5 min，期間搖動(dòng)2次。隨后迅速冷卻至室溫，將培養(yǎng)基通過0.2 μm無(wú)菌濾膜過濾到15 mL無(wú)菌離心管中。

2．2．4 接種和培養(yǎng)

取150 μL維生素H培養(yǎng)基加入孔中，然后將150 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品加入指定孔中，用粘性箔蓋住微孔條，37℃下于暗處充分封閉和孵育48 h。

2．2．5 測(cè)定和結(jié)果計(jì)算

取下粘性箔，用酶標(biāo)儀讀取630 nm處吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中維生素H標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)。用式（2）計(jì)算樣品中維生素H的含量，式中X為樣品中維生素H含量（ug/100 g）。

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法

表4 兩種方法測(cè)定維生素H含量的結(jié)果比對(duì)

圖1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定維生素H含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 試劑盒方法測(cè)定維生素H含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)果分析

3．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系

以維生素H質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，透光率或吸光度值為縱坐標(biāo)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法和試劑盒方法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見圖1和圖2。兩種方法均具有良好的線性關(guān)系。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定維生素H的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝81.671x2－160.98x＋89.334，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9978；試劑盒法測(cè)定維生素H的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝-1.1445x2＋1.7981x＋0.0412，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9982。

3．2 兩種方法測(cè)定結(jié)果比較

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法和試劑盒方法對(duì)市售10 款嬰兒配方奶粉的測(cè)定結(jié)果見表4，兩種方法的測(cè)定值相近，前者測(cè)定樣品維生素H含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.97%～7.31%，后者RSD為0.62%～5.88%，均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可信。

4 討論

兩種方法的測(cè)定結(jié)果均滿足《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》（GB10765-2010）的規(guī)定[11]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定維生素H含量需要前期將植物乳桿菌培養(yǎng)到最佳狀態(tài)，相對(duì)耗時(shí)，且測(cè)定結(jié)果與植物乳桿菌的活力關(guān)系很大，而試劑盒方法測(cè)定維生素H含量操作相對(duì)簡(jiǎn)單，且菌落已經(jīng)提前包被在96 孔板上[12]，減少了操作引起的誤差，可提高測(cè)定準(zhǔn)確性，并減少測(cè)定時(shí)間。