方慧華， 嚴士海， 周仲瑛， 李七一

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥學部，江蘇南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥理室，江蘇南京 210029；3.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇南京 210029）

雖然目前對慢性心力衰竭的治療取得了重大進展，但其發(fā)病率和死亡率仍然非常高，代謝功能障礙是該疾病的重要基礎(chǔ)機制[1-2］，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致心肌細胞結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂，是慢性心衰、心肌重塑、心肌缺血再灌注等多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3］。參葵通脈顆粒是課題組傳承國醫(yī)大師周仲瑛教授治療慢性心力衰竭臨床經(jīng)驗所創(chuàng)制的醫(yī)院制劑，其安全有效，可改善心功能、抗氧化應(yīng)激[4］。本實驗通過心肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型和血清藥理學研究方法，觀察參葵通脈顆粒對心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用，特別是對糖脂代謝紊亂的調(diào)控作用，為相關(guān)臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 新生3 d內(nèi)SD乳大鼠，雌雄兼有；8周齡SD大鼠，雄性，均由南通大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（蘇）2014-0001。

1.2 試藥 參葵通脈顆粒，組方炙黃芪20 g、靈芝20 g、仙靈脾10 g、桂枝 10 g、丹參 10 g、黃蜀葵 10 g、茯苓10 g、陳皮6 g。將桂枝、陳皮置于減壓濃縮罐中，加6倍量水蒸餾提取，收集揮發(fā)液，濾取多余煎液；余下6味藥與上述2味藥的藥渣合并，置于多功能提取罐中，加水煎煮2次，第1次加10倍量水浸泡0.5 h后煎煮1 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.22（70～75℃）的清膏。揮發(fā)液二次蒸餾，收集揮發(fā)油，乙醇溶解后加入含β-環(huán)糊精的飽和水溶液中攪拌3 h，0～4℃下冷藏過夜，抽濾，收集濾餅，40℃下干燥，得包合物。取適量糊精加到包合物中，流化床制粒，70℃下干燥，制粒，即得。由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供，批號20170612。二甲基亞砜 （DMSO）、H2O2、胰酶均購于美國Sigma公司；放射免疫沉淀分析裂解液、增強型雙金雞寧酸 （BCA）蛋白濃度檢測試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）試劑盒、細胞核蛋白與胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG均購自于凱基生物科技有限公司；磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 （p-AMPKα）、 腺苷酸活化蛋白激酶 （AMPKα）、 葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）、 脂肪酸轉(zhuǎn)位酶 （FAT／CD36）、 肉毒堿琥珀酰轉(zhuǎn)移酶-1（CPT-1）兔抗大鼠多克隆抗購于美國Cell Signaling公司；乳酸脫氫酶 （LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、丙二醛 （MDA）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 HF151UVCO2培養(yǎng)箱 （上海力申科學儀器有限公司）；倒置顯微鏡 （日本 Olympus公司）；凈化工作臺（上海手術(shù)器械廠）；酶標儀 （瑞士Tecan公司）。

2 方法

2.1 含藥血清制備 將SD大鼠隨機分成4組 （每組10只）：參葵通脈顆粒低劑量組，4.32 g生藥／kg，劑量為人臨床等效劑量的1／2，取4.32 g溶入10 mL蒸餾水中；參葵通脈顆粒中劑量組，8.64 g生藥／kg，劑量為人臨床等效劑量，取8.64 g溶入10 mL蒸餾水中；參葵通脈顆粒高劑量組，17.28 g生藥／kg，劑量為人臨床等效劑量的2倍，取17.28 g溶入10 mL蒸餾水中；空白血清組不給藥，給予等量蒸餾水 （上述藥物配置的溶劑）灌胃，每天1次，連續(xù)14 d。然后，大鼠腹主動脈取血，離心，收集血清，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 心肌細胞培養(yǎng) 取SD乳大鼠10只，浸入75%乙醇中使其窒息死亡，移入超凈臺內(nèi)，2%碘酊、75%酒精消毒皮膚，眼科鑷和眼科剪打開胸腔，取出心臟置于平皿中，冰冷緩沖液沖洗3次，剪成1～2 mm3碎塊，消化液在37℃下水浴消化8次，每次10 min，前2次消化液中含有較多的血細胞碎屑，棄去，收集后6次消化液，加等體積含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 000 r／min離心5 min，棄去上清液，加完全培養(yǎng)液將細胞沉淀混勻，制成心肌細胞懸液，移到培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)液1次，待心肌細胞均貼壁生長出偽足連成片狀后，即可用于實驗。

2.3 分組、建模及給藥 將培養(yǎng)好的乳鼠心肌細胞隨機分為5組：正常對照組，心肌細胞+空白血清；模型組，心肌細胞+H2O2+空白血清；參葵通脈顆粒低劑量組，心肌細胞+H2O2+低劑量參葵通脈顆粒；參葵通脈顆粒中劑量組：心肌細胞+H2O2+中劑量參葵通脈顆粒；參葵通脈顆粒高劑量組：心肌細胞+H2O2+高劑量參葵通脈顆粒。參考文獻 [5-6］， 細胞采用含有 H2O2（100 μmol／L） 的培養(yǎng)液（30%H2O2的濃度大約為 1×107μmol／L， 將其加到 1 mL 完全培養(yǎng)液中，再吸取上述液體10 μmol／L加到10 mL完全培養(yǎng)液中，即得）刺激大鼠原代心肌細胞2 h，造成心肌細胞氧化應(yīng)激損傷。根據(jù)上述分組情況，加入相應(yīng)的含10%含藥血清的培養(yǎng)液，而正常對照組與模型組加入含10%空白血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采集細胞，養(yǎng)上清液。

2.4 細胞上清液中LDH、CK-MB、MDA水平檢測 取細胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書加入試劑，采用分光光度法檢測LDH、CK-MB、MDA水平。

2.5 細胞內(nèi)ATP水平檢測 細胞按照試劑盒說明書比例加入裂解液，裂解時用移液槍反復(fù)吹打以使裂解液充分接觸裂解細胞，4℃、12 000 r／min下離心5 min，取上清，酶標儀檢測光密度，BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定各組蛋白濃度，進而檢測細胞內(nèi)ATP水平。

2.6 p-AMPKα、 AMPKα、 GLUT4、 FAT／CD36、 CPT-1 表達檢測 嚴格按試劑盒操作提取心臟總蛋白，BCA法定量蛋白。采用Western blot法，取蛋白40 g加入緩沖液變性，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，染色觀察條帶，TBST洗膜，5%脫脂牛奶 TBST封閉1 h，分別加兔抗大鼠 p-AMPKα、 AMPKα、 GLUT4、 FAT／CD36、CPT-1抗體，室溫下孵育2 h，TBST洗膜，加二抗反應(yīng)1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光試劑發(fā)光。通過凝膠圖像分析軟件進行吸光度掃描，計算 p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1蛋白條帶的吸光度與β-actin的比值。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過SPSS17.0軟件進行處理，計量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 參葵通脈顆粒對 LDH、CK-MB、MDA水平的影響 表1顯示，與正常對照組比較，模型組LDH、CK-MB、MDA水平顯著升高 （P＜0.05）；與模型組比較，參葵通脈顆粒組三者水平顯著降低 （P＜0.05）。

表1 參葵通脈顆粒對LDH、CK-MB、MDA水平的影響 （ n＝8）

表1 參葵通脈顆粒對LDH、CK-MB、MDA水平的影響 （ n＝8）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

--組別 LDH／（U·L1） CK-MB／（U·mL1） MDA／（nmol·mL-1）正常對照組 183.63±33.70 0.48±0.13 2.05±0.64模型組 529.87±63.36? 1.26±0.41? 17.95±2.64?參葵通脈顆粒低劑量組 399.34±52.98# 0.75±0.38# 9.32±1.52#參葵通脈顆粒中劑量組 329.65±59.41# 0.68±0.29# 7.73±2.33#參葵通脈顆粒高劑量組 306.42±52.02# 0.61±0.27# 6.82±1.37#

3.2 參葵通脈顆粒對ATP水平的影響 表2顯示，與正常對照組比較，模型組ATP水平顯著降低 （P＜0.05）；與模型組比較，參葵通脈顆粒組 ATP水平顯著升高 （P＜0.05）。

表2 參葵通脈顆粒對ATP水平的影響 （ n＝8）

表2 參葵通脈顆粒對ATP水平的影響 （ n＝8）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 ATP（nmol·mg-1）正常對照組 12.91±1.39模型組 2.76±0.88?參葵通脈顆粒低劑量組 6.79±1.19#參葵通脈顆粒中劑量組 8.48±1.71#參葵通脈顆粒高劑量組 9.19±2.02#

3.3 參葵通脈顆粒對p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1表達的影響 表3、圖1，與正常對照組比較，模型組 p-AMPKα／AMPKα表達顯著升高 （P＜0.05），GLUT4、 FAT／CD36、 CPT-1表達顯著降低 （P＜0.05）； 與模型組比較，參葵通脈顆粒組四者表達顯著升高 （P＜0.05）。

表3 參葵通脈顆粒對p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1表達的影響 （， n＝8）

表3 參葵通脈顆粒對p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1表達的影響 （， n＝8）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 p-AMPKα／AMPKα GLUT4／β-actin FAT／CD36／β-actin CPT-1／β-actin正常對照組 0.23±0.05 1.08±0.15 0.47±0.07 0.45±0.08模型組 0.55±0.07? 0.41±0.08? 0.09±0.04? 0.08±0.03?參葵通脈顆粒低劑量組 1.01±0.12# 0.61±0.06# 0.26±0.04# 0.25±0.04#參葵通脈顆粒中劑量組 1.51±0.16# 0.80±0.06# 0.31±0.08# 0.34±0.05#參葵通脈顆粒高劑量組 1.90±0.13# 0.95±0.15# 0.46±0.08# 0.42±0.04#

圖 1 各組 p-AMPKα、 AMPKα、 GLUT4、 FAT／CD36、CPT-1表達

4 討論

近年來研究表明，心肌能量代謝障礙是慢性心力衰竭的發(fā)生機制之一，該疾病發(fā)生時心肌氧化應(yīng)激嚴重，線粒體損傷，從而導(dǎo)致能量代謝障礙[7］。正常情況下，心肌細胞能利用多種能量底物 （脂肪酸、葡萄糖等），其中脂肪酸供給心臟60%～80%的能量，是主要來源，而發(fā)病時脂肪酸代謝受到抑制，糖酵解相對增加[8］。本實驗發(fā)現(xiàn)，參葵通脈顆粒對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細胞能量代謝損傷具有良好的改善作用。

參葵通脈顆粒由炙黃芪、靈芝、淫羊藿、桂枝、丹參、黃蜀葵、茯苓、陳皮等組成，方中炙黃芪益氣養(yǎng)元，扶正祛邪，養(yǎng)心通脈，健脾利濕，為補氣之要藥[9］；靈芝補氣安神，止咳平喘，延年益壽，用于心神不寧、失眠心悸、肺虛咳喘、虛勞短氣、不思飲食[10］，兩者共為君藥，共奏補心氣、安心神之功效；淫羊藿與桂枝共為臣藥，前者補腎陽，強筋骨，正合慢性心力衰竭心腎陽虛、失于溫運的病機[11］，而后者既可溫扶脾陽以助運水，又可溫腎陽、逐寒邪以助膀胱氣化，而行水濕痰飲之邪[12］，與前者同用時可溫陽化氣，增強君藥補氣行血之力；丹參、黃蜀葵、茯苓養(yǎng)血活血利水，共為佐藥，發(fā)病時心腎陽氣虧虛，不能推動血液運行，血脈不利，水飲內(nèi)停，而丹參功效活血祛瘀、安神寧心，黃蜀葵功效利尿通淋、活血、止血、消腫解毒，茯苓功效滲濕利水、寧心安神，三者合用，有行瘀血而新血不傷、養(yǎng)新血而瘀血不滯之功效；陳皮理氣健脾，燥濕化痰，用于發(fā)病時水濕困脾之脘腹脹滿，并可改善胃腸蠕動，促進諸藥吸收，亦為佐藥。諸藥合用，攻補兼施，扶正不留邪，祛邪不傷正，可促進泵功能恢復(fù)。

心肌細胞氧化損傷時，線粒體能量代謝障礙，細胞膜完整性遭到破壞，細胞通透性增加，膜內(nèi)酶外漏，而測定細胞培養(yǎng)上清液中LDH、CK-MB水平可反映細胞損傷程度。本實驗通過H2O2建立心肌細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)模型組LDH、CK-MB釋放增加，與正常對照組比較有顯著差異，表明細胞損傷嚴重；參葵通脈顆粒能顯著抑制兩者外漏。MDA是一種脂質(zhì)過氧化標志物，本實驗發(fā)現(xiàn)不同劑量參葵通脈顆粒均能顯著降低其水平，推測它具有抗自由基和穩(wěn)定細胞膜的作用。

線粒體氧化應(yīng)激水平增加時，可使其三磷酸腺苷合成減少[13］，AMPK被認為是細胞的 “油量表”，可檢測發(fā)現(xiàn)低能量狀態(tài)，此時磷酸化增加，激活內(nèi)源性保護蛋白，改善能量代謝[14］。本實驗發(fā)現(xiàn)，正常對照組p-AMPK表達較低，而受到氧化應(yīng)激刺激后略有增加；參葵通脈顆?？纱龠MAMPK磷酸化，改善心肌細胞代謝障礙。

脂肪酸是心肌細胞產(chǎn)生ATP能量的主要底物，CD36是心臟FAT的主要形式，為心臟利用和吸取脂肪酸的主要轉(zhuǎn)位酶[15］；CPT-1是心肌細胞線粒體利用脂肪酸的關(guān)鍵酶，可促進脂肪酸進入線粒體氧化[16］，當心肌細胞發(fā)生損傷時，F(xiàn)AT／CD36、CPT-1表達下調(diào)，表明脂肪酸代謝障礙。本實驗發(fā)現(xiàn)，參葵通脈顆?？纱龠MFAT／CD3、CPT-1，改善脂肪酸代謝障礙。

GLUT4負責細胞內(nèi)外葡萄糖轉(zhuǎn)移和運送，保護心肌細胞在氧化應(yīng)激損傷中生存足夠的能量[17］。本實驗發(fā)現(xiàn)，參葵通脈顆粒可促進GLUT4表達，從而提高葡萄糖利用。

綜上所述，參葵通脈顆粒對H2O2致乳鼠心肌細胞損傷具有良好保護作用，可促進細胞存活，抑制心肌酶譜分泌，其機制可能與調(diào)控糖脂代謝酶、改善心肌細胞能量代謝障礙有關(guān)。