徐玉玲， 譚悅琪， 彭 艷， 韓 嘯， 余 杰， 劉 濤

（成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川成都 610106）

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮，習(xí)稱 “川黃柏”[1］，始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，主要分布于四川東部、貴州、湖北、云南、湖南西北部[2］，其味苦、寒，歸腎、膀胱經(jīng)[1］，為臨床常用的中藥之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒、退虛熱之功效。黃柏生物活性成分除了提取物、總生物堿以外，還包括鹽酸小檗堿、黃柏堿、木蘭堿、巴馬汀、藥根堿、黃柏酮、黃柏內(nèi)酯等單體化合物[3］，其中鹽酸小檗堿因具有較好的藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是指以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，選取道地藥材或主產(chǎn)區(qū)藥材，經(jīng)加工炮制成合格飲片后再經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的中藥飲片水煎劑[4］。為規(guī)范中藥配方顆粒的質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)研究，加強標(biāo)準(zhǔn)化工作，國家藥典委員會于2016年8月頒布 《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（征求意見稿）[5］，要求中藥配方顆粒應(yīng)具有標(biāo)準(zhǔn)湯劑的基本屬性，在制備中除成型工藝外，其余應(yīng)與傳統(tǒng)湯劑基本一致，即以水為提取溶劑，通過物理方法進行固液分離、濃縮、干燥、顆粒成型等工藝生產(chǎn)，并且中藥配方顆粒藥效物質(zhì)應(yīng)與中藥飲片水煎湯劑基本保持一致。

本實驗以文件中標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法為基礎(chǔ)，鹽酸小檗堿為指標(biāo)成分，其轉(zhuǎn)移率及出膏率為評價指標(biāo)，對川黃柏配方顆粒中間體進行提取、濃縮、干燥工藝優(yōu)化，為建立符合其特點的制劑工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料

iChrom P5100型高效液相色譜儀 （大連依利特分析儀器有限公司）；BS-6KH型電子天平 （上海友聲衡器有限公司）；FA2004型電子分析天平 （上海良平儀器儀表有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵 （鄭州杜甫儀器廠）；RE-501型恒溫水油浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （成都康宇科技有限公司）；MH-3000型可調(diào)式電熱套 （北京科偉永興儀器有限公司）；FA-1A-50型冷凍干燥機 （北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；101-1-S型電熱鼓風(fēng)干燥箱 （成都雅源科技有限公司）。

川黃柏 （批號20170809）購自成都市荷花池中藥材市場，經(jīng)成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院劉濤研究員級高級工程師鑒定為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮。鹽酸小檗堿對照品 （批號wkq16072302，CAS：633-65-8，含有量＞98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿含有量測定

2.1.1 色譜條件 Supersil ODS2色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.1% 磷酸 （50 ∶50）（每100 mL加0.1 g十二烷基磺酸鈉）；檢測波長265 nm；柱溫25℃；體積流量1.0 mL／min；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品7.12 mg，置于100 mL量瓶中， “2.1.1”項下流動相稀釋至刻度，搖勻，即得 （質(zhì)量濃度71.2 μg／mL）。

2.1.3 供試品溶液制備 精密移取提取液1 mL或精密稱取干浸膏0.1 g，置于50 mL量瓶中，“2.1.1”項下流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1 鹽酸小檗堿HPLC色譜圖

2.1.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得鹽酸小檗堿峰面積RSD為1.24%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 取提取液 （批號20170809）適量，按 “2.1.3”項下方法制備6份供試品溶液，在 “2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得鹽酸小檗堿含有量RSD為2.08%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、12 h在 “2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得鹽酸小檗堿峰面積RSD為2.85%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 線性關(guān)系考察 精密移取對照品溶液2、4、6、8、10 mL，置于10 mL量瓶中，“2.1.1”項下流動相稀釋至刻度， 搖勻， 制得 14.24、 28.48、 42.72、 56.76、 71.20 μg／mL溶液，在 “2.1.1”項色譜條件下進樣10 μL測定。以峰面積 （Y）對溶液質(zhì)量濃度 （X）進行回歸，得鹽酸小檗堿方程為 Y＝31.385X+13.877（r＝0.999 9），在 14.24～71.20 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密移取含有量已知的提取液0.5 mL，置于50 mL量瓶中，精密加入2 mL對照品溶液（0.611 6 mg／mL），按 “2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，平行6份，在 “2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，鹽酸小檗堿平均加樣回收率為100.72%，RSD為1.85%。

2.1.9 鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率測定 取 “2.1.3”項下供試品溶液進行定量測定，計算鹽酸小檗堿總量，并與相應(yīng)飲片中鹽酸小檗堿總量相除，即為該成分轉(zhuǎn)移率。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備[6］稱取飲片120 g，加水煎煮2次。第1次加入10倍量水浸泡30 min，煮沸后再煎煮20 min，趁熱過濾；第2次藥渣再加入8倍量水，煮沸后再煎煮20 min，趁熱過濾，合并2次濾液，減壓濃縮 （≤50℃，-0.09 MPa）至掛壁狀，倒出，冰柜中預(yù)凍 （-10℃）過夜，冷凍干燥，即得。

2.3 中間體工藝優(yōu)化

2.3.1 提取工藝

2.3.1.1 提取溶劑選擇 中藥配方顆粒的制備應(yīng)與傳統(tǒng)湯劑基本一致，而且川黃柏的主要化學(xué)成分為生物堿鹽類，易溶于水，故選擇提取溶劑為水。

2.3.1.2 浸泡時間選擇 稱取飲片4份，每份50 g，加入8倍量水浸泡0、0.5、1、2 h，提取2次，每次1 h。結(jié)果，鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率分別為 62.41%、73.90%、68.33%、75.02%，可見未浸泡時轉(zhuǎn)移率較浸泡后低，并且浸泡時間大于0.5 h后無明顯差異，綜合考慮，故選擇浸泡時間為30 min。

2.3.1.3 正交試驗 稱取飲片9份，每份50 g，以加水量、提取次數(shù)、提取時間為影響因素，鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率及出膏率為評價指標(biāo)，正交試驗優(yōu)化提取工藝。因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析

由表3可知，因素A無顯著影響 （P＞0.05），因素B、C有極顯著影響 （P＜0.01），各因素影響程度依次為C＞B＞A，結(jié)合直觀分析結(jié)果及實際操作，確定最優(yōu)提取工藝為A1B3C3，即加8倍量水提取3次，每次2 h。

然后，取同一批飲片3份，分別為50、100、200 g，按 “2.3.1.3”項下優(yōu)化工藝進行驗證試驗。結(jié)果，鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率分別為 83.48%、91.51%、85.50%，RSD為4.81%；出膏率分別為27.95%、28.38%、28.20%，RSD為0.77%，表明工藝穩(wěn)定可行。

2.3.2 濃縮工藝 將 “2.3.1.3”項下驗證試驗中3份提取液合并混勻，取4份，每份200 mL，倒入潔凈干燥敞口錐形瓶中，于50、60、70、80℃水浴上濃縮2 h，冷卻后補足減失的質(zhì)量。結(jié)果，鹽酸小檗堿含有量分別為4.23%、4.26%、4.30%、4.25%，表明其轉(zhuǎn)移率隨濃縮溫度的變化不明顯，綜合考慮濃縮時間等因素，選擇濃縮溫度為80℃。

然后，取同一批飲片3份，每份50 g，按 “2.3.1.3”項下優(yōu)化工藝進行提取，藥液減壓濃縮 （80℃、-0.09 MPa）20 min后補足減失的質(zhì)量。結(jié)果，鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率分別為 82.74%、83.46%、76.83%，RSD為4.49%，表明工藝穩(wěn)定可行。

2.3.3 干燥工藝 取飲片100 g，加8倍量水提取3次，每次2 h，合并濾液，減壓濃縮 （80℃、-0.09 MPa）至掛壁狀，倒出稠膏，均分3份，分別進行常壓干燥 （80℃）、減壓干燥 （80℃、-0.08 MPa）、冷凍干燥，得干浸膏。結(jié)果，鹽酸小檗堿含有量分別為3.20%、3.23%、3.21%，可知3種干燥工藝無明顯差異，由于冷凍干燥所得樣品質(zhì)地疏松，加水后能迅速溶解，而且在真空狀態(tài)下干燥浸膏時不易氧化，有利于長期貯存，故選擇干燥工藝為冷凍干燥。

然后，將 “2.3.2”項下驗證試驗中的3份提取液繼續(xù)濃縮至掛壁狀，倒出，冰柜中預(yù)凍 （-10℃）過夜，冷凍干燥，得干浸膏。結(jié)果，鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率分別為80.82%、80.80%、83.73%，RSD為2.06%，表明工藝穩(wěn)定可行。

2.3.4 工藝比較 將標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝、配方顆粒中間體工藝進行比較，結(jié)果見表4，可知相較于標(biāo)準(zhǔn)湯劑，配方顆粒中間體鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率提高61.78%，出膏率提高54.75%。

表4 工藝比較結(jié)果

3 討論

自古以來，大多數(shù)中藥在臨床上的應(yīng)用均以水為溶劑進行提取，本實驗也將川黃柏配方顆粒提取方法明確為水提，使其與標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致，但這在某種意義上限制了各類先進提取工藝在配方顆粒中的應(yīng)用，阻礙了相關(guān)生產(chǎn)技術(shù)的進步，放棄了中藥飲片中水溶性不好的成分[7］。李玲慧等[8］發(fā)現(xiàn)，70%乙醇回流提取可獲得較高轉(zhuǎn)移率的鹽酸小檗堿；劉麗梅[9］等采用75%乙醇回流提取，河北安國黃柏提取物中總生物堿含有量及轉(zhuǎn)移率均顯著提高。目前，當(dāng)配方顆粒中間體工藝中有效成分轉(zhuǎn)移率高于標(biāo)準(zhǔn)湯劑時，有學(xué)者認(rèn)為應(yīng)該調(diào)整其生產(chǎn)參數(shù)，使其有效成分轉(zhuǎn)移率與標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致[10］，但這與目前新藥研發(fā)過程中的認(rèn)知不完全吻合。中醫(yī)藥發(fā)展本身就是隨著人類對外界事物的認(rèn)知逐漸完善成熟的過程，課題組認(rèn)為如果配方顆粒所用溶劑、出膏率、成分轉(zhuǎn)移率等指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致，則其中間體工藝與后者制備工藝應(yīng)完全一致，無法體現(xiàn)出中醫(yī)藥與時俱進的特點，同時 《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（征求意見稿）（《技術(shù)要求》）中有還有一些值得探討的地方[5］，故配方顆粒中間體工藝研究值得業(yè)內(nèi)人士共同探討，以促進產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

川黃柏為干燥樹皮，體輕，質(zhì)硬， 《技術(shù)要求》中規(guī)定 “待煎飲片應(yīng)先行浸泡，浸泡時間應(yīng)根據(jù)飲片的質(zhì)地確定，一般不少于30 min”[6］，故需考察浸泡時間是否會影響提取后的質(zhì)量或川黃柏中鹽酸小檗堿變化。趙學(xué)敏在《枟本草綱目拾遺枠》中指出 “今藥肆所售，仙半夏，惟將半夏浸泡，盡去其汁味……全無本性，是無異食半夏渣滓，何益之有”，“多泡無益”早已被認(rèn)知，歷代醫(yī)家大多主張 “少泡多潤”[11］。對于一些特殊藥材，如黃芩中所含黃芩酶在適宜溫度下，可在水溶液中將黃芩苷酶解為苷元類，若滿足一定藥材粒度條件，則能在一定時間內(nèi)將其完全酶解[12］；大青葉中大青素B易被共存的酶或弱堿水解生成吲哚醇，從而氧化成靛藍(lán)，發(fā)生性質(zhì)上的改變[13］，可見浸泡與否和藥材自身特性有極大的關(guān)系，而非標(biāo)準(zhǔn)湯劑規(guī)定的應(yīng)先行浸泡。

川黃柏為清熱燥濕藥， 《技術(shù)要求》中規(guī)定清熱類中藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑的煎煮時間為20 min[6］，而本實驗通過正交試驗確定最終提取時間為120 min，與文獻(xiàn) [14-15］報道一致，與標(biāo)準(zhǔn)湯劑差異較大。一方面，雖然標(biāo)準(zhǔn)湯劑源于傳統(tǒng)中藥湯劑，但既然中藥配方顆粒中間體工藝建立在標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝之上，就不應(yīng)拘束于傳統(tǒng)煎藥流程；另一方面，作為一種新型飲片，中藥配方顆粒應(yīng)同樣具備與傳統(tǒng)飲片一致的 “性味”特征，其開發(fā)不能簡單地理解為中藥顆粒劑開發(fā)，而應(yīng)建立一套符合其特點的工藝，最大限度 “保味存性”是每個工藝環(huán)節(jié)的要求，故應(yīng)使中藥配方顆粒與傳統(tǒng)中藥飲片相比做到 “變形而不變性”[16］。

濃縮、干燥是標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝中增加的2個重要工序， 《技術(shù)要求》中規(guī)定 “標(biāo)準(zhǔn)湯劑的濃縮溫度不超過50℃”[6］。溫度越低，時間越短，越有利于成分穩(wěn)定，但本實驗中鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率并未隨濃縮溫度變化而發(fā)生明顯改變，故在實際濃縮過程中應(yīng)綜合考慮受熱狀況對提取液中成分的影響，而非單一的規(guī)定濃縮溫度。中藥浸膏的傳統(tǒng)干燥方法主要有鼓風(fēng)烘箱干燥和普通真空干燥[17］，《技術(shù)要求》中規(guī)定 “標(biāo)準(zhǔn)湯劑的干燥一般采用冷凍干燥方法制備為宜”[6］，故本實驗考察了常壓干燥、減壓干燥、冷凍干燥3種方法，最終確定為冷凍干燥，與標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致，該方法由于在低溫下操作，能有效保護藥液中有效成分，適用于易氧化或熱敏性藥品的干燥，但設(shè)備復(fù)雜、耗能大、干燥成本高等因素限制了它在中藥工業(yè)中的應(yīng)用[18］。另外，噴霧干燥干燥效率高，對有效成分破壞少，所得浸膏粉細(xì)膩、均勻、含水量低，而且浸膏粉溶解性好，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，越來越被廣泛用于中藥浸膏干燥[17］，但該方法易出現(xiàn)物料粘壁而導(dǎo)致物料損失，而且難以處理高濃度、高黏性的中藥濃縮液[19］，故它在川黃柏配方顆粒制備中的應(yīng)用還有待進一步研究。

綜上所述，本實驗對川黃柏配方顆粒中間體工藝的優(yōu)化建立在標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝之上，并明確了提取、濃縮、干燥等環(huán)節(jié)的關(guān)鍵要素，可見當(dāng)前技術(shù)要求尚不成熟，固定的煎煮、濃縮、干燥等流程所制備的標(biāo)準(zhǔn)湯劑僅為一個參考，而非絕對性指導(dǎo)。因此，中藥配方顆粒的制備應(yīng)從中藥材本身出發(fā)，遵循其特征，對相關(guān)工藝不斷進行深入研究和完善，為加速該類制劑發(fā)展及中藥現(xiàn)代化奠定堅實基礎(chǔ)。