牟倩倩， 馬祖兵， 孫 強， 趙甜甜， 謝 龍， 李 化， 李小芳?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實，習(xí)稱北五味子，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心之功效[1］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，五味子木脂素類成分是五味子主要活性成分，以含有量較高的五味子醇甲為代表，具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞、保肝等多種藥理活性，對肝炎、腦病等有良好的治療作用[2-6］，2015版 《中國藥典》也將其作為該藥材質(zhì)量評價指標(biāo)成分。目前雖有多篇文獻(xiàn)報道了五味子醇甲的提取純化工藝[7］，但傳統(tǒng)方法 （煎煮法、滲漉法、回流法、乙醇沉淀法），普遍存在費時、效率低、樣品雜質(zhì)多等問題；雖新技術(shù) （微波提取法、超臨界提取法、高速逆流色譜法等）提高其提取純化效果，但設(shè)備成本較高，操作繁瑣，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

超聲提取法是通過超聲波所具有的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、機械效應(yīng)來提高溶劑分子運動速度及穿透力，用于提取中藥有效成分的一種新技術(shù)，以提取溫度低、時間短、提取率高的獨特優(yōu)勢在中藥提取中得到廣泛應(yīng)用。大孔樹脂是一種同時具備吸附及篩選功能的高分子聚合物，因其理化性質(zhì)穩(wěn)定、不受無機物影響、交換速度快、易解吸、再生處理簡單、價格便宜等諸多優(yōu)點被廣泛用于中藥活性成分的分離純化。因此，本實驗采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化五味子中五味子醇甲提取純化工藝，旨在為其他五味子木脂素類成分的提取純化提供參考，也為相關(guān)制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀 （日本島津公司）；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q型超純水制備儀（美國Millipore公司）；FW80型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；BT125D型電子天平 （德國Sartorius公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海愛朗儀器有限公司）；離心機 （德國Eppendorf公司）；THZ-22型恒溫?fù)u床 （太倉市實驗設(shè)備廠）；玻璃層析柱 （內(nèi)徑1.2 cm×40 cm）。

1.2 試藥 五味子購于北京同仁堂藥房，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所李化副研究員鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.的干燥成熟果實。五味子醇甲對照品購于成都曼斯特生物科技有限公司 （含有量＞99%，批號MUST-15041804）。AB-8、LX-22、X-5等大孔樹脂均購于鄭州勤實科技有限公司 （批號20160526）。甲醇為色譜純 （美國Fisher公司）；氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇等均為分析純。

2 五味子醇甲提取工藝優(yōu)化

2.1 含有量測定 參照2015版 《中國藥典》五味子項下含有量測定方法[1］，以五味子醇甲含有量為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，得到回歸方程為Y＝21 468X+8 548.6（R2＝0.999 8）， 在 7.725～92.70 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗 考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù) （40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、料液比（1 ∶5、 1 ∶10、 1 ∶20、 1 ∶30、 1 ∶40、 1 ∶50）、超聲時間 （5、 10、 20、 30、 40、 50 min）、 超聲溫度 （20、30、40、50、60、70℃） 對五味子醇甲提取率的影響，重復(fù)2次，初始條件設(shè)置為料液比1∶40，超聲時間20 min，提取溫度30℃，超聲功率100 W，結(jié)果見圖1。由圖可知，單因素試驗中最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，料液比1∶10，提取時間20 min，提取溫度40℃。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù) （A）、提取時間 （B）、提取溫度 （C）作為影響因素，五味子醇甲提取率（Y）作為評價指標(biāo)，設(shè)計3因素3水平 （共17組試驗，其中12個為析因點，5個為中心點）響應(yīng)面試驗。因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 提取工藝因素水平Tab.1 Factors and levels for extraction technique

圖1 各因素對五味子醇甲提取率的影響Fig.1 Effects of various factors on schisandrin extraction rate

表2 提取工藝試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Design and results of tests for extraction technique

然后，通過Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得二次多項回歸方程為Y＝0.55-0.016A+0.028B+0.019C-7.5×10-3AB-1.000×10-3AC+2.5×10-3BC-0.013A2-5.5×10-3B2-3.000×10-3C2， 方差分析見表3。由表可知，模型P＜0.01，表明模型顯著；失擬項P＞0.05，表明模型擬合度良好；校正決定系數(shù)0.923 2，表明92.32%的響應(yīng)值變化可用該模型來解釋；因素A、B、C對五味子醇甲提取率均有極顯著影響 （P＜0.01），影響程度依次為 B＞C＞A。

表3 提取工藝方差分析Tab.3 Analysis of variance for extraction technique

響應(yīng)面分析見圖2，可知最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)81.06%，提取時間13.96 min，提取溫度39.61℃，料液比 1∶10，五味子醇甲提取率0.581%，考慮到實際操作的可行性，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)81.00%，提取時間14 min，提取溫度40℃，料液比1∶10。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行5批驗證試驗，測得五味子醇甲提取率為0.587%，與預(yù)測值0.581%相當(dāng) （偏差0.71%），表明該工藝準(zhǔn)確可靠。

3 五味子醇甲純化工藝優(yōu)化

3.1 樣品溶液制備 稱取五味子干燥粉末適量，按最優(yōu)提取工藝提取五味子醇甲，合并濃縮提取液，適量去離子水定容，即得，并測定其質(zhì)量濃度C0。

圖2 各因素響應(yīng)面圖 （提取工藝）Fig.2 Response surface plots for various factors（extraction technique）

3.2 樹脂型號篩選 精密稱取預(yù)處理后的7種大孔樹脂（ AB-8、 X-5、 D-101、 LX-22、 LX-68、HPD450、LSA-21）各1.0 g，置于125 mL具塞磨口三角瓶中，加入已測定質(zhì)量濃度的樣品溶液30 mL（V1） 于搖床中，在25℃、80 r／min下吸附12 h以達(dá)到飽和，減壓抽濾，測定濾液中五味子醇甲質(zhì)量濃度C1。將充分吸附后的大孔樹脂用蒸餾水清洗至表面無樣品溶液殘留，抽濾，置于具塞磨口三角瓶中，加入 95%乙醇 50 mL（V2），25℃下振蕩12 h（80 r／min），測定解吸液中五味子醇甲質(zhì)量濃度C2，計算樹脂對該成分的吸附率及解吸率，公式分別為吸附率＝[（C0-C1） V1／C0V1]×100%、解吸率＝[C2V2／（C0-C1）V1］×100%，結(jié)果見圖3。由圖可知，AB-8大孔樹脂對五味子醇甲的吸附率和解吸率均最高，與前期報道[8］一致，故選擇其進(jìn)行下一步實驗。

圖3 大孔樹脂吸附率及解吸率Fig.3 Adsorption and desorption rates of macroporous resins

3.3 上樣液質(zhì)量濃度考察 取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹脂5 g，濕法上柱，配制0.05、0.1、0.2、0.3、 0.4 g／mL樣品溶液， 以 2 mL／min體積流量動態(tài)吸附，待上柱樣品溶液全部通過樹脂柱后收集流出液，測定五味子醇甲質(zhì)量濃度，計算吸附率，結(jié)果見圖4。由圖可知，隨著上樣質(zhì)量濃度增加吸附率先增加后降低，在0.1 g／mL時最高，故確定上樣液質(zhì)量濃度為0.1 g／mL。

圖4 上樣液質(zhì)量濃度對吸附率的影響Fig.4 Effect of sample concentration on adsorption rate

3.4 上樣液體積流量考察 取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹脂5.0 g，濕法上柱，將1.0 g／mL樣品溶液以0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0 mL／min體積流量上樣吸附，收集過柱殘液，測定五味子醇甲質(zhì)量濃度，計算吸附率，結(jié)果見圖5。由圖可知，上樣液體積流量在0.5～1.0 mL／min之間時吸附率變化不大，之后隨著其增加而逐漸降低，為縮短純化周期，故確定上樣液體積流量為1.0 mL／min。

圖5 上樣液體積流量對吸附率的影響Fig.5 Effect of sample volumetric flow rate on adsorption rate

3.5 上樣液用量考察 取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹脂5.0 g，濕法裝柱，將0.1 g／mL樣品溶液以1.0 mL／min體積流量連續(xù)上樣，流出液每20 mL收集1管，測定五味子醇甲質(zhì)量濃度，繪制泄漏曲線，結(jié)果見圖6。由圖可知，隨著上樣液用量增加流出液中泄漏的五味子醇甲含有量也隨之增加，達(dá)到160 mL時該成分明顯泄露，達(dá)到180 mL時其質(zhì)量濃度已超過初始的10%，故確定上樣液用量為160 mL。

圖6 上樣液用量對五味子醇甲質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of sample consumption on schisandrin concentration

3.6 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)考察 取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹脂5.0 g，濕法裝柱，將0.1 g／mL樣品溶液以1.0 mL／min體積流量上樣吸附，先用2 BV去離子水沖洗除雜，再用 30%、50%、70%、80%、95%乙醇各50 mL以1 mL／min體積流量洗脫，收集洗脫液，測定五味子醇甲質(zhì)量濃度，計算解吸率，結(jié)果見圖7。由圖可知，隨著洗脫劑體積分?jǐn)?shù)增加解吸率不斷增加，在80%時最高，之后逐漸下降，故確定洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖7 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響Fig.7 Effect of eluent concentration on desorption rate

3.7 洗脫劑體積流量考察 取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔樹脂5.0 g，濕法裝柱，將0.1 g／mL樣品溶液以1.0 mL／min體積流量上樣吸附，先用2 BV去離子水沖洗除雜，再用50 mL 80%乙醇以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL／min體積流量洗脫，收集洗脫液，測定五味子醇甲質(zhì)量濃度，計算解吸率，結(jié)果見圖8。由圖可知，隨著洗脫劑體積流量增加解吸率先稍有增加再緩慢下降，在2.0 mL／min時最高，故確定洗脫劑體積流量為2.0 mL／min。

圖8 洗脫劑體積流量對解吸率的影響Fig.8 Effect of eluent volumetric flow rate on desorption rate

3.8 洗脫劑用量考察 取經(jīng)預(yù)處理后的AB-8大孔樹脂5.0 g，濕法裝柱，將0.1 g／mL樣品溶液以1.0 mL／min體積流量上樣，先用2 BV去離子水洗滌，再用80%乙醇以2.0 mL／min體積流量洗脫，分段收集洗脫液，每份10 mL，測定五味子醇甲質(zhì)量濃度，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖9。由圖可知，當(dāng)洗脫劑用量達(dá)到50 mL時五味子醇甲基本洗脫完全，為更加充分地洗脫，故確定洗脫劑用量為60 mL。

圖9 洗脫劑用量對五味子醇甲質(zhì)量濃度的影響Fig.9 Effect of eluent consumption on schisandrin concentration

3.9 Box-Behnken響應(yīng)面法 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇上樣液質(zhì)量濃度 （A）、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)（B）、洗脫劑用量 （C）作為影響因素，五味子醇甲收率 （Y，吸附率×解吸率）作為評價指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken中心試驗方案進(jìn)行3因素3水平設(shè)計。因素水平見表4，結(jié)果見表5。

表4 純化工藝因素水平Tab.4 Factors and levels for purification technique

然后，通過Design Expert軟件對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得二次多項回歸方程為Y＝90.94-4.51A+3.27B+1.63C-0.002 5AB+0.11AC-2.41BC+1.55A2-8.64B2-5.24C2，方差分析見表6。由表可知，模型P＜0.01，表明模型顯著；失擬項P＞0.05不顯著，表明模型擬合程度良好；校正決定系數(shù)0.973 0，表明97.30%的響應(yīng)值變化可用該模型來解釋；因素A、B、C、BC、A2、B2、C2對五味子醇甲收率有顯著影響 （P＜0.05），影響程度依次為A＞B＞C。

表5 純化工藝試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.5 Design and results of tests for purification technique

表6 純化工藝方差分析Tab.6 Analysis of variance for purification technique

響應(yīng)面分析見圖10，可知最優(yōu)純化工藝為上樣液質(zhì)量濃度 0.06 g／mL，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)84.35%，洗脫劑用量61.98 mL，五味子醇甲收率95.155%，考慮到實際操作可行性，將其修正為上樣液質(zhì)量濃度0.06 g／mL，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)85%，洗脫劑用量62 mL。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗證試驗，測得五味子醇甲收率為94.51%，與預(yù)測值95.155%相當(dāng) （偏差 0.33%），同時含有量為46.54%，表明該工藝準(zhǔn)確可靠。

圖10 各因素響應(yīng)面圖 （純化工藝）Fig.10 Response surface plots for various factors （purification technique）

4 討論

王磊[9］對五味子醇甲超聲提取工藝進(jìn)行研究，但僅考察了提取溶劑、料液比、超聲功率3個因素。本實驗在此基礎(chǔ)上補充了提取時間、提取溫度，使該工藝條件更系統(tǒng)，而且優(yōu)化所得提取溶劑、料液比及該條件下五味子醇甲提取率與該報道一致，表明該結(jié)果準(zhǔn)確可靠。李洪洋等[10］對五味子醇甲大孔樹脂純化工藝進(jìn)行研究，但僅采用單因素試驗優(yōu)化上樣液質(zhì)量濃度等幾種參數(shù)，而且未測定吸附率、解吸率、收率、含有量等，本實驗在單因素試驗基礎(chǔ)上通過Box-Behnken響應(yīng)面法考察影響其純化效果的工藝條件，使實驗結(jié)果更具體準(zhǔn)確。

同時，本研究比較了甲醇和乙醇作為提取溶劑對五味子醇甲提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)后者效果稍優(yōu)，同時考慮到工業(yè)生產(chǎn)中它相對更加安全、便宜，故選擇乙醇作為提取溶劑。