謝錄翰，康春婷，孫菊鮮，侯 婕，葛 欣

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

β-胡蘿卜素具有較強的抗氧化作用，廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、食品、化妝品等多種領(lǐng)域［1］。三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）是目前已知的β-胡蘿卜素和番茄紅素高產(chǎn)菌株，用生物發(fā)酵手段生產(chǎn)的類胡蘿卜素較物理化學(xué)提取手段具有產(chǎn)量高、安全性強、生物活性完全和經(jīng)濟效益高等多種優(yōu)點。特別值得注意的是，在三孢布拉氏霉菌的代謝途徑中，番茄紅素是生產(chǎn)β-胡蘿卜素的前體物，番茄紅素的生物學(xué)和營養(yǎng)學(xué)價值要更高于β-胡蘿卜素，其具有消除人體自由基、預(yù)防衰老、抗癌抗腫瘤等多種功效［2-3］。

三孢布拉氏霉菌是一種單細胞多核生物體，菌絲體和孢子在傳代和培養(yǎng)的過程中易退化。三孢布拉氏霉菌分為正（+）、負（-）2種單性菌株，負菌株是番茄紅素生產(chǎn)菌株，正菌株在負菌的生長過程中主要提供三孢酸等性激素來刺激負菌株番茄紅素的積累［4］。在單獨培養(yǎng)正、負菌株時，番茄紅素產(chǎn)量較低，絕大部分高產(chǎn)和低產(chǎn)菌株顏色差異不顯著，其在初篩過程中根據(jù)菌絲顏色判斷菌株產(chǎn)量差異較困難。因此，通過物理化學(xué)等誘變手段篩選產(chǎn)量差異菌株并建立一種較為高效的初篩手段對于三孢布拉氏霉菌菌株的選育具有重大意義。

目前，常規(guī)的誘變手段有紫外（UV）誘變、亞硝基胍（NTG）誘變、N+注入誘變和常壓室溫等離子體誘變（atmospheric and room temperature plasma，簡稱ARTP）等，由于三孢布拉氏霉菌是單細胞多核生物體，不同的誘變手段對孢子的誘變效率千差萬別。Rodriguez等利用紫外線、亞硝基胍和甲基磺酸乙酯（EMS）分別對B.trispora（+）和B.trispora（-）進行復(fù)合誘變，誘變后的負菌株在添加三孢酸的平板上生長，菌落顏色差異顯著，以此作為番茄紅素產(chǎn)量差異菌株初篩標準［5］。Mehta等通過NTG處理B.trispora孢子，經(jīng)過接合培養(yǎng)方式培養(yǎng)，獲得產(chǎn)量達39 mg/g的β-胡蘿卜素的兩性異核體以及番茄紅素環(huán)化酶缺陷型菌株［6］。王強利用N+注入、ARTP和NTG等多種誘變處理方式誘變B.trispora，篩選出了3株高產(chǎn)番茄紅素突變株，番茄紅素產(chǎn)量為0.97 g/L，其高產(chǎn)菌株的hmg R、car RA、car B基因的表達水平對比野生型菌株顯著提高［7］。

綜合比較眾多學(xué)者的多種誘變處理方式，發(fā)現(xiàn)ARTP和亞硝基胍的處理措施誘變效果最顯著。由于亞硝基胍對環(huán)境造成污染以及對試驗人員有致癌威脅，因此，ARTP誘變是較為安全高效的誘變措施。ARTP技術(shù)是采用氦氣為工作氣體的常壓室溫等離子體源，其中含有多種化學(xué)活性粒子成分，如OH、氮分子二正系統(tǒng)、氮分子一負系統(tǒng)、激發(fā)態(tài)氦原子、氫原子和氧原子等，使三孢布拉氏霉菌成熟孢子的DNA遺傳物質(zhì)損傷，生物體通過高容錯的修復(fù)機制產(chǎn)生豐富的錯配位點，進而引起突變［8］。

眾多研究學(xué)者對三孢布拉氏霉菌誘變的研究都集中在篩選高產(chǎn)突變體，往往忽略了負突變菌株的價值。由于三孢布拉氏霉菌番茄紅素代謝調(diào)控復(fù)雜，負突變菌株也能從側(cè)面解析其代謝調(diào)控過程，所以，無論是正突變菌株還是負突變菌株，只要菌絲顏色與野生型存在差異均具有研究價值。

三孢布拉氏霉菌隸屬于毛霉目（Mucorales）笄霉科（Choanephoraceae）布拉氏霉菌屬（Blakeslea），其代謝途徑如圖1所示［9-11］。

在其復(fù)雜的代謝途徑中，HMG-CoA還原酶是番茄紅素合成過程中的限速酶。洛伐他汀是一種降血脂藥物，可以抑制HMG-CoA還原酶的活性，從而降低膽固醇等的合成［12］。洛伐他汀平板能夠增加突變效率，形成HMG-CoA還原酶基因突變菌株或HMG-CoA還原酶過表達菌株［7］。脫氧膽酸鈉（SDC）可以抑制菌絲體的蔓延，易于突變菌株的計數(shù)和分離。因此，利用洛伐他汀和SDC的麥芽汁平板培養(yǎng)菌株，通過顏色差異即β-胡蘿卜素產(chǎn)量差異初篩表型差異菌株，即為β-胡蘿卜素產(chǎn)量差異菌株。

本研究旨在利用ARTP技術(shù)篩選菌絲顏色差異突變體，在洛伐他汀脅迫下篩選β-胡蘿卜素產(chǎn)量差異菌株，高產(chǎn)菌株在工業(yè)方面具有較大利用價值，高、低產(chǎn)差異性菌株對于研究其生物代謝途徑、探索色素合成的相關(guān)基因的表達調(diào)控具有潛在價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種及藥品 三孢布拉氏霉菌NRRL 2896（-），由筆者所在實驗室保存；洛伐他汀，購自黑龍江肇東華富藥業(yè)有限責任公司；脫氧膽酸鈉，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 儀器 ARTP誘變系統(tǒng)，購自北京思清源生物科技有限公司；SPX型生化培養(yǎng)箱，購自寧波東南儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 產(chǎn)孢培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂12 g/L，0.1% SDC。

誘變培養(yǎng)基：5°麥芽汁，12 g/L瓊脂，0.1% SDC。

篩選培養(yǎng)基：5°麥芽汁，12 g/L瓊脂，0.1% SDC，5 mg/L洛伐他汀。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備與致死率的計算 將三孢布拉氏霉菌接種至產(chǎn)孢培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3～4 d，收集孢子保藏并計數(shù)。將孢子懸液濃度調(diào)至106個/mL，取10μL孢子懸液涂于誘變的金屬片上，處理時間分別為0、40、80、120、160、200、240 s，處理距離為2 mm，氣體流量為10 L/min。將處理后的金屬片轉(zhuǎn)移至EP管中，加入1mL緩沖液，渦旋振蕩2min，充分混合金屬片中的孢子，吸取100μL涂布平板，每組重復(fù)2次。將涂布平板置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，觀察孢子萌發(fā)和菌落生長狀況，計數(shù)并計算致死率，致死率＝（對照菌落數(shù)-誘變菌落數(shù)）/對照菌落數(shù)×100%，并確定ARTP誘變時間。

1.2.2 顏色差異菌株的初篩與表型性狀穩(wěn)定性的鑒定 誘變菌株在含有5 mg/L洛伐他汀的篩選培養(yǎng)基上生長2 d，觀察菌絲顏色差異，初篩出與未處理組有較大差異的菌株，劃線篩選培養(yǎng)基平板，傳代并純化，收集孢子獲得傳代后的孢子液。將顏色差異菌株孢子和對照組涂布誘變培養(yǎng)基平板，生長2 d，待菌絲長出后同等條件下繼續(xù)生長24～48 h，觀察菌絲顏色變化，驗證顏色差異菌株表型性狀穩(wěn)定性。

1.2.3 三孢布拉氏霉菌色素的提取與全波長掃描鑒定 色素提取方法參照文獻［13］并稍作改動。接種三孢布拉氏霉菌置于含100 mL 5°麥芽汁的250 mL三角瓶中，在28℃培養(yǎng)箱以200 r/min轉(zhuǎn)速條件下發(fā)酵5 d，紗布過濾得到菌絲體，無菌水洗滌3次。將菌絲體置于干燥箱，40℃烘干至恒質(zhì)量，準確稱取0.1 g菌絲于研缽中，加入0.5 g石英砂，在陰暗避光條件下，向研缽中加入乙酸乙酯充分研磨，將研磨破碎物轉(zhuǎn)移至離心管中，用乙酸乙酯定容至10 mL，充分萃取至菌絲無色。吸取乙酸乙酯提取的色素，離心取上清，用乙酸乙酯作對照，測定色素提取物的全波長。

1.2.4 β-胡蘿卜素標準曲線的制備與不同突變株色素產(chǎn)量測定 準確稱量β-胡蘿卜素10 mg，用少量三氯甲烷溶解，并用乙酸乙酯稀釋定容至10 mL，取此液1 mL，稀釋至100 mL，此時β-胡蘿卜素的濃度為10 mg/L，即β-胡蘿卜素標準液。吸取β-胡蘿卜素標準液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，用乙酸乙酯定容至10 mL。在456 nm處測定吸光度，制備標準曲線。將發(fā)酵后的菌絲烘干，準確稱取0.1 g菌絲體，充分研磨后用10 mL乙酸乙酯萃取，離心后吸取上清在456 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線換算色素含量，色素含量定義為1 g干質(zhì)量菌絲所含色素的質(zhì)量（mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變處理致死率

為了確定最優(yōu)的ARTP誘變時間，對三孢布拉氏霉菌的孢子在同等條件下不同處理時間進行致死率計算，致死率曲線如圖2所示。隨著ARTP處理時間的延長，菌落存活數(shù)逐漸降低，致死率呈上升趨勢，ARTP處理時間小于80 s時，其致死率大幅上升，處理時間在80～240 s之間時，致死率上升速度減緩，處理240 s時，致死率達到96%以上。結(jié)果表明，三孢布拉氏霉菌孢子的誘變時間選擇在160～200 s最佳，此時致死率在90%左右，能夠滿足誘變條件，理論上可以獲得最佳的誘變菌株。

2.2 誘變處理平板結(jié)果

經(jīng)不同時間處理的孢子存活率存在差異，其誘變后生長情況如圖3所示。經(jīng)ARTP誘變處理后，孢子存活率明顯下降，在處理時間為160～200 s時，100μL涂布誘變孢子液，平板上生長的菌落數(shù)較少。由于突變具有低概率性和偶然性，當菌落數(shù)較少時不利于突變體的篩選。因此，可以在誘變時適當增加涂布量以保證足夠的誘變孢子存活，從而能夠更好地滿足篩選條件，獲得更為理想的突變體。

2.3 顏色差異菌株性狀表型

根據(jù)以上試驗條件確定誘變處理時間，選擇160、200 s 2個時間點作為誘變處理時間。突變體在含有洛伐他汀的平板上菌絲體呈現(xiàn)不同顏色，挑選的顏色差異突變株與野生型菌株置于同一平板上培養(yǎng)，觀察菌絲顏色差異，其顏色差異情況如圖4所示。洛伐他汀擴大了突變株的顏色差異，在含有洛伐他汀的誘變平板中，突變體大致呈現(xiàn)出4種顏色，分別為深黃色、黃色、淺黃色、白色；初篩的突變株在不含洛伐他汀的平板中，菌絲顏色與野生型菌株相比顏色差異明顯，表現(xiàn)為深黃色、黃色、淺黃色、白色。

2.4 顏色差異菌株傳代純化

突變體由于自身基因的非特異性改變，部分菌株不能維持原有的色素產(chǎn)量，直觀地表現(xiàn)為菌株顏色與篩選初期不一致。為保證突變菌株的穩(wěn)定性，挑選多株突變菌株傳代培養(yǎng)，經(jīng)傳代后部分菌株表型性狀改變，挑選表型性狀穩(wěn)定菌株傳代5次，復(fù)篩突變體，部分表型性狀穩(wěn)定菌株傳代后如圖5所示，顏色差異各組經(jīng)純化和傳代后，菌落顏色差異明顯，顏色表現(xiàn)為深黃色、黃色、淺黃色和白色等4種類別，其中深黃色的正突變菌株和白色的負突變菌株顏色差異明顯。

2.5 顏色差異性菌株表型性狀穩(wěn)定性

為了驗證顏色差異菌株表型性狀穩(wěn)定性，選取深黃色和白色2種類別菌株為代表進行持續(xù)培養(yǎng)，多時間段觀察其表型變化，其結(jié)果如圖6所示，A組為對照組，在平板上生長2 d后，對照組菌絲顏色呈暗黃色，持續(xù)生長24～48 h后顏色穩(wěn)定；B組為深黃色突變株，生長2 d后菌絲顏色為深黃色，持續(xù)生長24 h后菌絲顏色加深，持續(xù)生長48 h后菌絲顏色與持續(xù)生長較24 h后菌絲顏色無明顯差異；C組為白色菌株突變株，生長2 d后菌絲顏色為白色，持續(xù)生長24～48 h菌絲顏色仍為白色。

2.6 不同顏色突變株產(chǎn)孢能力差異性

為保存顏色差異突變株，在PDA平板上培養(yǎng)菌體使其產(chǎn)孢，獲得可保存的孢子，不同顏色差異菌株的產(chǎn)孢情況如圖7所示，A組為對照組，經(jīng)產(chǎn)孢培養(yǎng)后孢子大量產(chǎn)生；B組為黃色突變株，產(chǎn)孢能力與對照組無明顯差別；C組為白色突變株，經(jīng)產(chǎn)孢培養(yǎng)后產(chǎn)孢能力明顯下降，幾乎不產(chǎn)孢。

2.7 三孢布拉氏霉菌色素全波長掃描

為確定三孢布拉氏霉菌菌絲中色素的吸收波長，將菌絲研磨破碎，提取色素全波長掃描，其全波長掃描結(jié)果如圖8所示，色素在456 nm處具有最大吸光度，因此，此波長下的吸光強度可以用于表征色素的特征吸收光譜，依據(jù)文獻［13-15］所述，于450 nm左右產(chǎn)生的吸光度主要由β-胡蘿卜素產(chǎn)生，可以用來表征該色素的濃度。

2.8 制備β-胡蘿卜素標準曲線

為通過吸光強度測定β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，通過不同濃度色素的吸光度制備標準曲線，根據(jù)試驗操作選取的β-胡蘿卜素濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L，β-胡蘿卜素濃度（x）與吸光度（y）呈線性關(guān)系，其方程為y＝0.072 5x-0.018 5，r2＝0.997 9。通過標準曲線，結(jié)合本試驗方法，其色素含量計算公式如下：

色素含量＝［（D+0.018 5）÷0.072 5］×10÷1 000÷0.1。

其中：D為吸光度。

2.9 不同突變株色素產(chǎn)量

由于三孢布拉氏霉菌的菌絲色素成分是復(fù)雜的，在450 nm左右的吸光度主要由β-胡蘿卜素產(chǎn)生，所以可以通過β-胡蘿卜素的標準曲線測定菌絲中色素含量。根據(jù)上述試驗步驟，其突變株在平板中存在顏色差異，挑選不同突變株對其菌體色素含量測定，根據(jù)β-胡蘿卜素標準曲線測定色素含量，其結(jié)果如表1所示，菌株1和菌株5的顏色與對照組相比為黃色，菌株10與對照組相比為白色。菌株1和菌株5為β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株，在未進行任何培養(yǎng)條件優(yōu)化的前提下，β-胡蘿卜產(chǎn)量分別提高48.6%、40.4%；菌株10為負突變菌株，β-胡蘿卜產(chǎn)量下降16.5%。

3 討論

ARTP誘變系統(tǒng)處理三孢布拉氏霉菌孢子其致死率隨處理時間的延長逐漸增加，這與王強所做的不同ARTP處理時間下三孢布拉氏霉菌存活率的結(jié)果［7］基本一致，在處理160～200 s時，致死率在90%以上，正負突變株在平板上顏色明顯。洛伐他汀平板上生長的對照組顯淺黃色，誘變處理的突變株在平板上表現(xiàn)出顏色差異，ARTP誘變后的洛伐他汀選擇壓力能夠使菌落產(chǎn)生較為明顯的顏色差異，與未誘變的對照組相比，將顏色差異菌株分為4等，分別為深黃色、黃色色、淺黃色和白色，且正突變效率高于負突變效率，可能的原因是洛伐他汀有助于篩選HMG-CoA還原酶過表達菌株，從而增強其代謝途徑，促進正突變。純化后菌株顏色差異明顯，純化后的菌株在傳代過程中部分菌株表型性狀改變，主要表現(xiàn)在負突變菌株顏色加深回歸至野生型狀態(tài)，部分菌株傳代后表型性狀穩(wěn)定性較強，與原性狀保持一致，其顏色表型與色素產(chǎn)量吻合。三孢布拉氏霉菌的菌絲中色素經(jīng)乙酸乙酯萃取后，其最高吸收峰位于456 nm處，這和顧秋亞［13］、王洪波［14］、劉星等［15］測定的菌絲中β-胡蘿卜素含量的波長基本一致，均在450 nm附近，此波長下吸光度主要由β-胡蘿卜素產(chǎn)生，但由于菌絲中色素成分復(fù)雜，β-胡蘿卜素含量是高估的。在產(chǎn)孢培養(yǎng)過程中，正突變菌株產(chǎn)孢明顯，負突變菌株基本不產(chǎn)孢，可能是負突變菌株抗逆性增強，其產(chǎn)孢差異原因還需深入研究。

表1 不同突變株色素產(chǎn)量及顏色表型

4 結(jié)論

建立了三孢布拉氏霉菌ARTP誘變顏色差異菌株篩選手段，在洛伐他汀脅迫下獲得了顏色差異明顯、遺傳性狀穩(wěn)定的突變株共10株，其中深黃4株、黃色3株、淺黃2株、白色1株，正突變株產(chǎn)量上升48.6%，負突變株產(chǎn)量下降16.5%。