林標(biāo)聲，陳 意，羅茂春，張浣星，林占熺

［1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖 364012；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；3.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州 350002；4.奧蘭多（杭州）實(shí)業(yè)有限公司，浙江杭州310051］

Klebsiella variicola GN02是從巨菌草（Pennisetum sinense Roxb）成熟期根部分離得到的一株具有較高固氮酶活性［378.22 nmol/（mL·h），以C2H4還原量計(jì)］的內(nèi)生固氮菌，前期試驗(yàn)表明其具有良好的溶磷，產(chǎn)氨、產(chǎn)鐵載體，分泌抗生素等促生性能，是制備微生物復(fù)合菌肥的潛在良好菌株來源［1］。K.variicola GN02屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬菌株，而克雷伯氏菌屬的多類菌株是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌，因而人們對K.variicol在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用一直存在一定的疑慮［2］。多年來，農(nóng)業(yè)微生物和工業(yè)污染治理等方面的研究表明，克雷伯氏菌對植物本身不表現(xiàn)致病性，而且還是一種有效的綠色菌肥和高效凈化劑［3］；但也有人認(rèn)為與植物聯(lián)合固氮的K.variicola菌株和人源Klebsiella spp菌株之間的遺傳差異較小，都有K.pneumoniae的致病相關(guān)因子，因此將其制備成微生物菌肥在田間施用具有一定的風(fēng)險(xiǎn)［4］。因此，有必要對K.variicola GN02進(jìn)行非致病性安全性鑒定，明確其是否安全、無毒。

植物內(nèi)生固氮菌與植物在長期進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育過程中建立了一種聯(lián)合的關(guān)系［5］，大量研究表明，禾本科植物接種內(nèi)生聯(lián)合固氮菌后能行固氮作用，但由于固氮菌株、植物類型、生長環(huán)境等條件的不同，其固氮量存在較大的差異（4.5%～21.2%）［6］。15N同位素稀釋法能準(zhǔn)確區(qū)分和測定植物不同生長時(shí)期、不同來源的氮源，成為了植物內(nèi)生固氮菌固氮量測定的、較為準(zhǔn)確和常用的方法［7］，目前在許多豆科植物和禾本科植物中都有應(yīng)用［8-9］，但尚未發(fā)現(xiàn)其在巨菌草中固氮菌的研究中應(yīng)用。

因此，本研究以GB 15670—1995《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》為依據(jù)［10］，對K.variicola GN02進(jìn)行系統(tǒng)的毒理性試驗(yàn)研究，并以K.pneumoniae不同血清型特異性靶基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，對K.variicola GN02進(jìn)行血清型分型，進(jìn)一步明確其和臨床上傳染性K.pneumoniae之間的聯(lián)系。此外，本研究還采用了15N同位素稀釋法評價(jià)GN02菌株在巨菌草不同生長時(shí)期根莖葉中的固氮效率，以期為生產(chǎn)上以GN02菌株制備微生物固氮菌肥，并在巨菌草及其他禾本科植物中的實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基及供試動(dòng)物

K.variicola GN02：由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從巨菌草成熟期根部分離，并經(jīng)16SRNA和促生性能鑒定后在中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏（CGMCC 1.13619）；肺炎克雷伯氏菌（K.pneumonia）購自杭州濱和微生物試劑有限公司，菌種保藏號CMCC46117；Ashby無氮培養(yǎng)基：甘露醇10 g/L，KH2PO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaSO4·2H2O 0.1 g/L，CaCO35.0 g/L，pH值7.0～7.2；昆明小鼠，體質(zhì)量18～20 g；Wistar成年大鼠，體質(zhì)量200～300 g，均購自福建省閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司；供試菌液為1.5×108CFU/g GN02菌株培養(yǎng)液（或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)16～20 h）。

1.2 主要試劑和儀器

15NH4Cl，豐度30.15%，上海化工研究院合成；DNA marker，各限制性內(nèi)切酶購自天根生化科技（北京）有限公司。

石蠟切片機(jī)，萊卡RM2016，徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；研究型正置顯微鏡，尼康DS-Fi2，尼康儀器（上海）有限公司；PCR儀，ABI-2720，美國Applied Biosystems公司；電泳儀，Mini Pro 300V Power Supply，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 K.variicola GN02急性毒性試驗(yàn)

1.3.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 按最大限量法選擇健康昆明小鼠40只，雌雄各半，平均分成對照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組將準(zhǔn)備好的GN02菌株供試菌液按0.1 mL/10 g經(jīng)口灌胃給予小鼠（對照組用同等濃度生理鹽水灌胃），灌胃前動(dòng)物隔夜禁食、自由飲水。灌胃后給予正常飲食，觀察14 d，記錄小鼠中毒體征及死亡情況，按GB 15670—1995《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》中所列參考依據(jù)評定GN02菌株毒性。同時(shí)，將兩組小鼠隨機(jī)抽取3只分別進(jìn)行呼吸道解剖和肺部的石蠟切片觀察，進(jìn)一步確定2組小鼠接種GN02菌株的病理變化情況。

1.3.2 大鼠急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn) 按最大限量法，選擇Wistar成年大鼠20只，雌雄各半，平均分成對照組和試驗(yàn)組。先將2組大鼠分別北部剃毛，面積20 cm2（4 cm×5 cm）。試驗(yàn)組在略小于剃毛面積內(nèi)用滅菌棉簽涂抹GN02菌液（0.1 mL/10 g BW 用量），對照組用同等濃度生理鹽水敷藥，后用保鮮膜覆蓋剃毛區(qū)域，并用膠布固定，防止大鼠舔食菌液，涂藥時(shí)間持續(xù)4 h，其間觀察并記錄2組大鼠是否有中毒現(xiàn)象。涂藥結(jié)束后，用溫水徹底清洗大鼠涂抹皮膚上的菌液，再繼續(xù)觀察14 d，再次觀察和記錄2組大鼠的中毒體征及死亡情況。按上述的國家標(biāo)準(zhǔn)判斷GN02菌株毒性，同樣對2組大鼠進(jìn)行呼吸道解剖和肺部石蠟切片觀察，進(jìn)一步確定2組大鼠接種GN02菌株的病理變化情況。

1.4 GN02菌株血清型檢測

GN02菌株DNA的提取采用細(xì)菌基因組提取試劑盒［天根生物化科技（北京）有限公司］，采用PCR擴(kuò)增相關(guān)基因，以固氮菌特異性基因NifH和肺炎克雷伯氏菌臨床上最為流行的7種分型（K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57）設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行鑒定。7種分型的引物序列參考相關(guān)文獻(xiàn)，由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成；NifH 特異性引物為：引物F，5′-AATGACCATGCGTCAATGC-3′；引物R，5′-GTGAGGATC CTGTGCTCAG-3′。將提取DNA統(tǒng)一濃度為100 ng/μL作為PCR反應(yīng)體系模板，以無菌去離子水作為陰性對照；同時(shí)提取臨床上常見的K.pneumoniae CMCC46117基因組DNA，同樣以7種分型特異性引物進(jìn)行鑒定作為對比。PCR反應(yīng)體系（25μL）：DNA模板0.5μL，H2O 7.5μL，引物F（10μmol/L）1μL，引物R（10μmol/L）1μL，2×Taq PCR Master Mix 10μL；PCR反應(yīng)條件：94℃4 min；94℃45 s，58℃45 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.5 K.variicola GN02對巨菌草生物固氮的影響

1.5.1 采用15N同位素稀釋法 將溫室中培養(yǎng)好的巨菌草小苗（5～10 cm）從秧苗培育盤中取出，將根部清洗干凈，在超凈臺上將苗用2%次氯酸鈉表面消毒5～10 min，再用無菌水清洗，用滅菌小刀輕劃根系，再浸入對數(shù)生長期的GN02菌株培育菌液中30 min，同時(shí)以無菌水蒸餾水浸泡為對照。

將試驗(yàn)用土過篩、高壓滅菌后分裝于16.5 cm×11 cm的塑料盆（購自鑫騰花卉專營店，江蘇宿遷），每盆施入1.5 g15NH4Cl，對照組和試驗(yàn)組各栽11盆，共22盆，每盆栽巨菌草苗各3～5株。用無菌水配制無氮培養(yǎng)基營養(yǎng)液，每隔5 d澆無菌水600～800 mL/桶，每隔10 d澆此營養(yǎng)液600～800 mL/桶，直至試驗(yàn)結(jié)束。

1.5.2 固氮量和固氮率的測定 分別在巨菌草生長的苗期、分蘗期、拔節(jié)期和成熟期4個(gè)時(shí)期，將塑料桶剪開，除去植株根部泥土、洗凈，每時(shí)期取樣3桶，包括根、莖和葉，剪碎、混勻，60～70℃烘干，各樣品分別取1 g送至上海化工研究院測定全氮含量和15N原子百分超。按下列公式計(jì)算植株的固氮量和固氮率，并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析（SPSS 17.0軟件）。

2 結(jié)果與分析

2.1 GN02菌株急性毒性試驗(yàn)

小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)和大鼠急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)表明，小鼠灌胃和大鼠經(jīng)皮涂菌后，動(dòng)物均未發(fā)現(xiàn)明顯的中毒現(xiàn)象，連續(xù)觀察14 d，也均未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡現(xiàn)象（表1），試驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物解剖也未發(fā)現(xiàn)異常，動(dòng)物呼吸道（特別是肺部）沒有發(fā)現(xiàn)明顯的病變（圖1）；與對照組相比，試驗(yàn)組的肺部石蠟切片不同部位的對比觀察也未發(fā)現(xiàn)明顯的異常（圖2）。按GB 15670—1995《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》中所列參考依據(jù)評定GN02菌株毒性為微毒以下，無明顯毒性，可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。

表1 GN02菌株急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 GN02菌株血清分型的結(jié)果

以肺炎克雷伯氏菌臨床上最為流行的7種分型引物對GN02菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3所示，以GN02-DNA為模板，NifH引物擴(kuò)增為陽性；分別以H2O、GN02-DNA為模板，7種分型引物擴(kuò)增均為陰性；以K.pneumoniae CMCC46117-DNA為模板，7種分型引物擴(kuò)增鑒定為K2分型。該研究結(jié)果表明，GN02菌株具有固氮菌特異性基因NifH，但不屬于7種臨床上流行的肺炎克雷伯氏菌分型，不是流行的肺炎克雷伯氏菌強(qiáng)毒力菌株，不會(huì)引起嚴(yán)重的臨床疾病。

2.3 GN02菌株對巨菌草生物固氮的影響結(jié)果

將GN02菌株接種于巨菌草，其不同生長時(shí)期根莖葉的固氮率和固氮量見表2。結(jié)果表明，GN02菌株在不同生長時(shí)期巨菌草根莖葉中均具有一定的固氮能力；根、莖、葉固氮率和固氮量均為成熟期＞拔節(jié)期＞分蘗期＞苗期，各成熟期固氮率可達(dá)15%～27.27%，與其他禾本科植物所報(bào)道的固氮菌固氮效率基本相當(dāng)［11-12］，且各成熟期固氮率和固氮量與其他時(shí)期相比均達(dá)到了顯著差異（P＜0.05），表明隨著種植時(shí)間的延長，GN02固氮菌株數(shù)量逐漸增加，固氮效率也逐漸提高；而在同一生長時(shí)期，不同部位的固氮率和固氮量均表現(xiàn)為葉＞根＞莖，且各生長時(shí)期葉的固氮率和固氮量與根、莖相比差異葉均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。

3 小結(jié)

近年來，許多學(xué)者都報(bào)道了K.variicola能夠在甘蔗［13］、石斛［3］、香蕉［4］等植物內(nèi)部定殖，并具有良好的固氮促生性能，但同時(shí)人們對K.variicola對動(dòng)物和植物的潛在致病性一直存在擔(dān)憂，對其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用持謹(jǐn)慎態(tài)度。

本試驗(yàn)研究了一株從巨菌草中分離的內(nèi)生固氮菌Klebsiella variicola GN02的毒理性固氮能力，結(jié)果表明，GN02菌株無明顯的經(jīng)口毒性和經(jīng)皮毒性，不是臨床上流行肺炎克雷伯氏菌已有分型的強(qiáng)毒力菌株；GN02菌株在不同生長時(shí)期巨菌草根莖葉中均具有一定的固氮能力，不同生長時(shí)期其固氮率和固氮量均為成熟期＞拔節(jié)期＞分蘗期＞苗期，在同一生長時(shí)期其固氮率和固氮量均為葉＞根＞莖；根莖葉各成熟期固氮百分率可達(dá)15%～27.27%，與其他禾本科植物所報(bào)道的固氮菌固氮效率基本相當(dāng)。表明GN02菌株安全、無毒，具有一定的固氮能力，可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用，并為將來以其為菌株資源制備固氮菌肥、挖掘應(yīng)用潛能、在綠色農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要作用奠定理論基礎(chǔ)［14］。

表2 不同生長時(shí)期巨菌草根、莖、葉的固氮率和固氮量