高華山，陳明輝，齊 光，張 科，佟偉霜

（平頂山學(xué)院，河南平頂山 467000）

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）是蘭科石斛屬植物，又名金釵石、扁黃草等，是《中華人民共和國藥典》［1］收錄的名貴石斛屬藥用植物之一，具備潤肺止咳、明目強(qiáng)身、生津益胃等功效。金釵石斛，性微寒，味甘，用于治療熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱、目暗不明、萎縮性胃炎、淺表性胃炎、慢性結(jié)腸炎等，是石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛浸膏溶液、石斛清胃散等制劑的重要配伍［2］。作為傳統(tǒng)中藥，金釵石斛近年來受到國內(nèi)外學(xué)者高度關(guān)注，藥理研究表明，金釵石斛具有提高腸道功能［3］、改善記憶衰退［4］、抗腫瘤［5］、抗誘變［6-7］、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力及降血糖等作用［8-9］。近幾十年來，國內(nèi)外學(xué)者對許多種石斛的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該屬植物所含的化學(xué)成分種類豐富，主要包括生物堿類、多糖類、酚類、黃酮類、聯(lián)芐類、倍半萜類、香豆素以及甾體糖苷類化合物等［10］，其中以生物堿和多糖為研究對象的工作較多。陳志國等對金釵石斛多糖進(jìn)行了體外抗氧化活性研究，結(jié)果表明，金釵石斛粗制多糖和精制多糖均有一定的抗氧化能力［11］。費雯等研究了金釵石斛總多酚的體外抗氧化活性，結(jié)果表明金釵石斛總多酚對ABTS、DPPH自由基和羥基自由基活性均有不同程度的清除作用，其清除能力與總多酚質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，具有良好的抗氧化能力［12］。但是，目前對于其黃酮類成分的制備工藝及相關(guān)活性研究的較少。因此本試驗在前期研究基礎(chǔ)上采用超聲波輔助提取法提取金釵石斛總黃酮并應(yīng)用響應(yīng)面法對總黃酮提取工藝影響較大的4個因素即料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得經(jīng)濟(jì)、科學(xué)的提取條件。以維生素C為陽性對照，考察金釵石斛總黃酮對ABTS、DPPH自由基和羥基自由基的清除作用，以期為進(jìn)一步探討其藥理活性和開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

UVmini-1240紫外可見分光光度計，日本島津生產(chǎn)；KQ3200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；SHB-ⅢS型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海廣英公司生產(chǎn)；102-1型恒溫鼓風(fēng)干燥箱，永興儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 材料

金釵石斛，購自平頂山張仲景大藥房，藥材干燥后粉碎過80目篩，貯存?zhèn)溆?；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，北京中科質(zhì)檢技術(shù)有限公司生產(chǎn)；DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；ABTS自由基［2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）］，上海金穗生物科技有限公司生產(chǎn)；羥自由基試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；維生素C標(biāo)準(zhǔn)品，北京中科質(zhì)檢技術(shù)有限公司生產(chǎn)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 測定方法

1.3.1 金釵石斛總黃酮的提取與測定 準(zhǔn)確量取2.0 g乙醇作為溶劑，在一定溫度下利用超聲波處理一定時間，趁熱抽濾，用相應(yīng)的提取溶劑補(bǔ)足損失，作為待測液。精確量取1.0 mL待測液于10 mL的比色管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定待測液的吸光度，計算黃酮含量。公式如下：

式中：C為待測液中的黃酮濃度，mg/mL；V為黃酮提取液體積，mL；N為待測液的稀釋倍數(shù)；m為金釵石斛樣品干質(zhì)量，取2.0 g。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取蕓香苷對照品20.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解，再用50%乙醇稀釋至100 mL，得0.2 mg/mL蕓香苷對照品溶液，分別量取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蕓香苷對照品溶液于6個10 mL比色管中，分別加入50%乙醇溶液使之成5 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，分別用50%乙醇稀釋至10 mL，搖勻后放置15 min，用不加蕓香苷對照品溶液的第1支管作空白，用紫外可見分光光度計在510 nm處測其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、蕓香苷濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［13］，得y＝13.12x+0.042 6，r2＝0.999 9。結(jié)果表明，蕓香苷在濃度0.02～0.10 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

1.4 試驗方法

1.4.1 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性與精確度試驗 精確量取供試品溶液1 mL，按“1.3.2”節(jié)中的測定方法操作，測定吸光度，連續(xù)測6次，吸光度的RSD＝1.03%，說明儀器精密度較好。將供試品溶液分別放置0、2、4、8、12、24 h后，測定總黃酮含量，結(jié)果顯示其RSD＝3.13%（n＝6），說明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性較好。按“1.3.1”節(jié)中總黃酮的提取方法平行制備6份樣品，按“1.3.2”節(jié)的測定方法操作，測定吸光度，結(jié)果吸光度的RSD＝2.42%，表明該測定方法的重復(fù)性良好。精確稱取6份已知含量的樣品粉末2.0 g，分別加入一定量的蕓香苷對照品溶液（0.2 mg/mL），按“1.3.1”節(jié)總黃酮的提取方法制成待測液，再按“1.3.2”節(jié)的方法測定吸光度，計算含量及回收率，其平均回收率為92.5%（RSD＝3.60%，n＝6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

1.4.2 金釵石斛總黃酮單因素試驗提取工藝優(yōu)化 以超聲法提取金釵石斛總黃酮，考察料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對金釵石斛黃酮提取的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對金釵石斛黃酮提取量的影響

2.1.1 料液比對黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱取金釵石斛粉末2.0 g，以體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇、溫度為55℃條件下浸提30 min，考察1 g∶10 mL、1 g∶20 mL、1 g∶30 mL、1 g∶40 mL、1 g∶50mL 5種不同料液比條件下對黃酮提取量的影響。從圖1-A可以看出，金釵石斛黃酮提取量隨溶劑的增加呈先增大后降低的趨勢，料液比在1 g∶20 mL時，黃酮提取率達(dá)到最大值，之后隨溶劑的增加而呈現(xiàn)平緩下降趨勢。原因可能是料液比在1 g∶20 mL時，溶劑中黃酮的溶解度已經(jīng)趨于飽和，即使繼續(xù)增加溶劑用量，黃酮提取量也沒有顯著提高，故選最佳料液比為1 g∶20 mL。

2.1.2 溫度對黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱取金釵石斛粉末2.0 g，以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇、料液比1 g∶20mL浸提30min，考察45、55、65、75、85℃5種不同溫度條件下對黃酮酚提取量的影響。從圖1-B可以看出，在溫度未達(dá)到65℃時，黃酮提取量隨溫度升高不斷升高；溫度超過65℃后，黃酮提取量隨溫度升高反而下降。這可能是由于溫度小于65℃時，物料的黏滯度減小，黃酮物質(zhì)很容易溶解析出，黃酮提取量隨溫度升高而增大，至65℃時達(dá)到最高，而溫度超過65℃時，較高的溫度可能會破壞黃酮結(jié)構(gòu)造成其提取量下降，故而選擇提取溫度為65℃左右較為合理。

2.1.3 提取時間對黃酮提取量的影響 精確稱取金釵石斛粉末2.0 g，在體積分?jǐn)?shù)60%乙醇、料液比1 g∶20 mL、溫度55℃條件下考察10、20、30、40、50 min 5種不同提取時間對黃酮酚提取量的影響。從圖1-C可以看出，黃酮提取量隨著時間延長反而呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，在提取時間為10 min時，黃酮提取量最高；提取20～30 min，黃酮提取量下降較快，在30～50 min時基本保持不變。10 min時黃酮提取量最高且節(jié)約時間，故而選取提取時間為10 min左右。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取量的影響 準(zhǔn)確稱取金釵石斛粉末2.0 g，在料液比1 g∶20 mL、溫度55℃條件下浸提30 min，考察50、60、70、80、90% 5種不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下對黃酮酚提取量的影響。從圖1-D可知，黃酮提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時達(dá)到最大。這可能是因為隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，材料細(xì)胞的溶脹增強(qiáng)，促進(jìn)提取試劑有效地向細(xì)胞內(nèi)滲透，從而增加提取率［14］。另外可能是由于金釵石斛黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，與醇類極性相似的黃酮類物質(zhì)析出更多，溶劑極性過大或過小對總酚提取均有一定影響。從本試驗結(jié)果來看，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時，黃酮提取量達(dá)最大值，故選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%左右。

2.2 金釵石斛總黃酮提取響應(yīng)面試驗設(shè)計及優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，由Design-Expert8.0.6統(tǒng)計分析軟件設(shè)計出試驗方案，以金釵石斛黃酮提取量為響應(yīng)值，以料液比（X1）、提取溫度（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）為自變量，建立4因素3水平中心組合試驗設(shè)計共包括17個試驗方案，其中12個析因試驗點、5個中心試驗點，用以計算試驗誤差。因素水平分析選取見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 應(yīng)用Design-Expert 8.0.6對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到料液比X1、提取溫度X2、乙醇體積分?jǐn)?shù)X3與金釵石斛總黃酮含量之間的二次多項回歸方程為：Y＝0.51+0.022X1+0.027X2+0.029X3-0.045X21-0.024X22-0.043X23-0.028X1X2-0.036X1X3+0.041X2X3，R2＝0.995 6，＝0.990 0，由方差分析可知回歸方程模型極顯著（P＜0.000 1），說明該模型與實際擬合良好，試驗方法可靠，失擬項P值為0.074 8＞0.05，不顯著，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，可以用該回歸方程代謝試驗真實點對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，料液比（X1）、提取溫度（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）對總黃酮提取量的工藝影響極顯著；二次項料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的曲面效應(yīng)均極顯著；比較各因子間料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互項、提取溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互項對響應(yīng)值影響顯著，各因素對響應(yīng)值顯著性的排序為X3＞X2＞X1。

表1 響應(yīng)面法試驗因素水平編碼

表2 中心試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

2.2.3 各因素的交互作用 將其中1個因素固定在0水平，經(jīng)軟件Design-Expert 8.0.6獲得其他2個因素交互作用和對金釵石斛黃酮量的影響。“3D”圖坡度越大越陡峭，說明二者交互最有越強(qiáng)；等高線的想著趨向于橢圓且橢圓軸線與坐標(biāo)軸的角度越大，交互作用越明顯。由圖2可知，響應(yīng)面坡度陡峭，等高線呈橢圓，說明料液比（X1）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）對黃酮提取率的影響均較大。由響應(yīng)面的等高線圖2可知，料液比1 g∶20 mL～1 g∶30 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%～90%的范圍內(nèi)黃酮提取量較高。料液比（X1）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）交互作用顯著，可能是因為料液比會影響溶質(zhì)分子質(zhì)量濃度，因而對金釵石斛黃酮的提取量產(chǎn)生交互影響。不同因素對金釵石斛黃酮提取量的影響非簡單的線性關(guān)系。

由回歸方程優(yōu)化得出因素水平的最優(yōu)組合，并將各因素水平轉(zhuǎn)換為實際值，得到金釵石斛黃酮提取的最佳工藝參數(shù)為：料液比1 g∶15.43 mL、提取溫度75℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為89.96%。考慮到實際操作可行性，將最佳提取工藝優(yōu)化為：料液比1 g∶15 mL，提取溫度75℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%。

2.2.4 驗證試驗 根據(jù)修正的最佳工藝條件，進(jìn)行6次重復(fù)試驗，測得金釵石斛中總黃酮的提取量為0.551 5 mg/g（RSD＝1.24%，n＝6），與預(yù)測的黃酮提取量0.551 4 mg/g較為接近，表明運用響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.3 抗氧化性試驗

2.3.1 ABTS自由基清除活性 將維生素C標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為3 000.00、1 500.00、750.00、375.00、187.50、93.75、46.875μg/mL的樣品液。分別取維生素C及各樣品液0.1 mL，加入1 mL ABTS溶液，充分混合，室溫避光放置20 min，用紫外分光光度計在734 nm處測定吸光度。超純水為空白對照用，重復(fù)3次［15-16］。按下式計算清除率：

表3 回歸模型的方差分析

樣品和維生素C對ABTS自由基的清除能力見圖3-A，結(jié)果表明，樣品對ABTS自由基的清除能力呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到1 500μg/mL的時候，金釵石斛黃酮對ABTS自由基的清除能力接近于維生素C，在更高濃度時（2 000～3 500μg/mL），其清除能力達(dá)100%。表明金釵石斛黃酮對ABTS自由基有良好的清除能力。通過SPSS軟件計算維生素C 和金釵石斛的IC50值分別為343.56、684.89μg/mL，表明金釵石斛黃酮對ABTS自由基的清除能力仍低于維生素C。

2.3.2 DPPH自由基清除活性 將維生素C標(biāo)準(zhǔn)品及金釵石斛黃酮提取液配制成濃度為3 000.00、1 500.00、750.00、375.00、187.50、93.75、46.875μg/mL的樣品液。分別取維生素C及各樣品液0.3 mL，加入0.9 mL DPPH甲醇溶液（0.1 mmol/L），室溫暗反應(yīng)30 min，用紫外分光光度計在517 nm處測定吸光度［17-18］?？瞻讓φ沼贸兯鏄悠芬海貜?fù)3次。按下式計算：

樣品和維生素C對DPPH自由基的清除能力見圖3-B，結(jié)果表明，樣品對DPPH自由基的清除能力與其濃度呈正相關(guān)，在0～750μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著黃酮濃度的增加，對DPPH自由基的清除能力顯著增強(qiáng)。當(dāng)濃度達(dá)到1 000μg/mL時，金釵石斛黃酮對DPPH自由基的清除能力接近最大值，約90%。表明金釵石斛黃酮對DPPH自由基有良好的清除能力。但通過SPSS軟件計算維生素C和金釵石斛的IC50值分別為139.23、425.34μg/mL，表明金釵石斛黃酮對DPPH自由基的清除能力仍低于維生素C。

2.3.3 清除羥自由基活性 將維生素C標(biāo)準(zhǔn)品及金釵石斛黃酮提取物配制成濃度為3 000.00、1 500.00、750.00、375.00、187.50、93.75、46.875μg/mL的樣品液。采用羥自由基試劑盒檢測，用紫外分光光度計在550 nm處測定吸光度?？瞻讓φ沼贸兯鏄悠芬?，重復(fù)3次。計算清除率：

樣品和維生素C對羥自由基的清除能力如圖3-C，結(jié)果表明，維生素C對羥自由基有很好的清除能力，且與其濃度呈正相關(guān)，隨著維生素C濃度的增加，對羥自由基的清除能力顯著增強(qiáng)。金釵石斛黃酮對羥自由基的清除能力也呈現(xiàn)一定程度的濃度依賴性，但其羥自由基清除能力低于陽性對照的維生素C，在高濃度4 000μg/mL時，其清除率為51.8%，表明金釵石斛黃酮具有一定的清除能力。通過SPSS軟件計算維生素 C 和金釵石斛的 IC50值分別為438.46、1 046.43μg/mL，表明金釵石斛黃酮對羥自由基的清除能力較對ABTS和DPPH這2種自由基的清除能力弱。

2.4 金釵石斛黃酮對間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）的保護(hù)作用

將第3代的MSC細(xì)胞接種96孔板，細(xì)胞濃度為1.5×105mL，每孔加入100μL細(xì)胞液，邊緣孔加無均水保濕，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，換液，每孔加入含不同濃度藥物（10、20、40、80、160、320μg/mL）的完全培養(yǎng)液100μL，每濃度設(shè)置5個復(fù)孔，空白組和H2O2組加入100μL完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，避光條件，每孔加入6 mmol/L H2O210μL，空白組不加H2O2，培養(yǎng)2 h后取出，每孔加20μL細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8），繼續(xù)培養(yǎng)2 h，與490 nm處酶標(biāo)儀測定各孔吸光度。試驗結(jié)果表明，在H2O2能夠明顯引起MSC的傷，與空白組相比具有顯著差異（P＜0.001）。與H2O2比較，除10μg/mL濃度組外，金釵石斛黃酮均能不同程度地保護(hù)MSC免受H2O2的損傷，黃酮濃度20μg/mL時開始有保護(hù)作用，到80μg/mL時保護(hù)作用最強(qiáng)，活性達(dá)到正常細(xì)胞的80%，損傷保護(hù)作用結(jié)果見圖4。

3 討論與結(jié)論

采用響應(yīng)面法對金釵石斛黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了黃酮提取量的回歸模型，由該模型優(yōu)化的黃酮提取條件為提取時間10min、料液比1 g∶15 mL，提取溫度75℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%。根據(jù)修正的最佳工藝條件，進(jìn)行6次重復(fù)試驗，測得黃酮提取量的均值為（0.551 5±0.000 4）mg/g，與模型預(yù)測值相符，進(jìn)一步驗證了該模型的可靠性?？寡趸钚栽囼灡砻?，金釵石斛黃酮對ABTS自由基、DPPH自由基的清除作用明顯，對羥自由基有一定的清除能力。金釵石斛黃酮清除ABTS自由基、DPPH 自由基的IC50值分別為684.89、425.34μg/mL，說明金釵石斛黃酮具有較好的抗氧化活性，在天然抗氧化劑等領(lǐng)域具有較好的開發(fā)潛力。