韓現芹，陳永平，郭華陽，李春青，姜巨峰，高麗娜

［1.農業(yè)農村部漁業(yè)環(huán)境及水產品質量監(jiān)督檢驗測試中心（天津），天津 300221；2.中國水產科學研究院南海水產研究所/農業(yè)農村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東廣州 510000；3.天津市水產研究所，天津300221］

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）隸屬蝶形目（Pleuronectiformes）、舌鰨科（Cynoglossidae）、舌鰨屬（Cynoglossus），俗稱牛舌頭、鰨目、鰨米，是一種暖溫性近海大型底層魚類。因其具有廣溫、廣鹽、適應范圍廣、個體大及生長快的特點，是我國目前最具開發(fā)潛力的工廠化和土池養(yǎng)殖海水品種之一。近年，隨著中國經濟的快速發(fā)展，生態(tài)環(huán)境遭到了嚴重的破壞，養(yǎng)殖用水污染直接關系到水產品的質量安全。各級政府、水產相關部門及廣大消費者對水產品質量安全越來越重視，其中多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）具有親脂性和難降解性、通過生物富集并沿生物鏈逐級擴大等特點，日益引起人們對其普遍關注。PCBs由有機氯化合物組成，有多達209個同分異構體和同系物［1］。據報道，PCBs對生物的生殖、內分泌、神經等系統(tǒng)危害巨大［2］，在中國造成了廣泛的污染，尤其水體受到了嚴重污染。據調查，海河表層水體中PCBs的含量為0.31～3.11μg/L［3］，我國境內部分水體PCBs含量遠遠超過美國環(huán)保局的標準［4］，污染嚴重。

國內外關于PCBs對魚類及水生生物的急性毒性試驗已有諸多報道［5-6］，但有關PCBs對半滑舌鰨的毒性作用研究尚未見相關報道。PCB153（2，2′，4，4′，5，5′-六氯聯(lián)苯）是PCBs 209個同分異構體的其中一種，本研究采用靜水生物測試法研究了PCB153對半滑舌鰨幼魚的急性毒性和抗氧化酶活性的影響，目的在于了解PCB153對半滑舌鰨幼魚的安全濃度并初步探討PCB153對魚類可能的致毒機制，同時為漁業(yè)部門監(jiān)測污染和保護水環(huán)境資源提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

半滑舌鰨于2018年3月取自天津乾海源養(yǎng)殖場，平均體長為（1.23±0.06）cm，體質量為（0.09±0.01）g，試驗魚在養(yǎng)殖場試驗室水族缸暫養(yǎng)7 d后進行試驗，試驗前1 d開始禁食。

1.2 試驗藥品

PCB153購于上海安譜科技有限公司，純度為99.5%。試驗時添加少量丙酮為助溶劑，濃度控制在0.1%左右。預先配制成1 000μg/L母液，再根據試驗需要稀釋成相應的質量濃度。

1.3 試驗條件

試驗用水為養(yǎng)殖場的過濾海水，水溫為23℃，pH值為6.8，鹽度2.3%。試驗在25 cm×40 cm×30 cm的水族缸中進行，試驗期間持續(xù)充氣，不投喂餌料。每一水族缸中加入5 L試驗液，并隨機放入受試半滑舌鰨10尾。

1.4 試驗方法

1.4.1 急性毒性試驗 設處理組和對照組。處理組：參照李娜等的方法［7］將PCB153配成較大質量濃度范圍的溶液對半滑舌鰨進行預試驗，觀察48 h后，確定最高耐受質量濃度及最低全致死質量濃度。在此基礎上運用等對數法，配成不同試驗質量濃度，分別為PCB153溶液4.00、11.31、32.00、90.50、256.00μg/L。添加丙酮對照組（試驗中所用丙酮最大濃度），根據靜水法生物測試［8］，試驗期間不喂食，全天持續(xù)充氣，不更換藥液。每個濃度3個平行，每個水族缸中加入10 L試驗液，并隨機放半滑舌鰨10尾，分別于24、48、72、96 h時記錄死亡數量。半滑舌鰨的中毒癥狀主要表現為：體色發(fā)白，失去游泳能力，用解剖針碰觸，無反應為死亡，即可從水中撈出。

1.4.2 慢性毒性試驗 設處理組和對照組。參考OECD標準方法PCB153質量濃度范圍約為LC50-48h的1/120～1/6，處理組質量濃度梯度為1、2、5μg/L，0μg/L為對照組（丙酮濃度0.1%）。每個處理組水族箱加入20 L試驗液，放半滑舌鰨20尾。在暴露后24、48、72和96 h時，每組分別取3尾，迅速放入封口袋中，置-80℃冰箱保存，測定不同濃度處理組半滑舌鰨幼魚肌肉的超氧化物歧化酶（SOD）、脂質過氧化產物丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽硫轉移酶（GST）活性。

1.5 酶活性的測定

（1）粗酶液制備：采用預冷的生理鹽水沖洗肌肉組織，再用濾紙吸去表面水分，稱取適量的樣品，按1 g∶10 mL加入4℃預冷生理鹽水，在冰浴條件下，采用勻漿器勻漿。勻漿液于冷凍離心4 000 r/min 10 min，取上清液備用。

（2）酶活性測定：樣品上清液中蛋白含量、SOD、MDA、CAT和GST測定試劑，均購自南京建成生物工程研究所，操作按試劑盒說明書進行。

1.6 數據處理

結果均表示為“平均數±標準誤”。使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件one-way ANVOA（單因素方差分析）對組間數據進行分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 PCB153對半滑舌鰨幼魚的急性毒性

急性毒性結果中，不同質量濃度PCB153對半滑舌鰨造成不同程度傷害，受試個體先表現為失去平衡力，在水中側翻或打轉。持續(xù)數小時后有些個體游動變得緩慢，逐漸喪失運動能力，躺臥缸底。死亡率隨藥物質量濃度的增加呈上升趨勢，直至全部死亡。暴露不同時間后，半滑舌鰨幼魚的死亡情況見表1。4.0μg/L處理組48 h開始出現死亡；256.0μg/L處理組72 h內全部死亡。

通過記錄各試驗組半滑舌鰨24、48、72、96 h死亡數，以計算平均死亡率，通過轉換成概率單位［9］，計算出試驗液質量濃度對數。用直線內插法，以質量濃度常用對數為橫坐標，死亡率概率單位為縱坐標，求出概率單位與試驗液質量濃度對數的回歸方程。求出半數致死質量濃度LC50及各自95%可信限，采用常規(guī)方法96 h LC50×0.1計算安全質量濃度為0.928μg/L（表2）。按照毒性分級標準（表3），PCB153對半滑舌鰨為劇毒物質。

表1 半滑舌鰨在不同質量濃度的PCB153溶液中的急性致死率

表2 PCB153對半滑舌鰨急性毒性試驗數據的線性回歸分析

表3 有毒物質對魚類的毒性標準［10］

2.3 PCB153對半滑舌鰨幼魚SOD活性的影響

由圖1可知，與對照組相比，3個處理組24 h后SOD活性升高到第一個高峰并出現極顯著性差異（P＜0.01），誘導率分別為22.7%、102.0%和116.0%；隨著暴露時間的延長，48 h后達到第二個高峰（P＜0.01），誘導率分別為190.0%、208.0%、311.0%。72 h后開始回落，2、5μg/L處理組SOD活性仍被極顯著誘導（P＜0.01），1μg/L處理組SOD活性低于對照組（P＜0.01），抑制率為18.4%。96 h后2、5μg/L處理組SOD活性逐漸恢復至對照組水平，1μg/L處理組SOD活性繼續(xù)降低。由此可見，SOD活性主要表現為先誘導后抑制。

2.4 PCB153對半滑舌鰨幼魚CAT活性的影響

由圖2可知，與對照組相比，暴露24 h內CAT活性未見明顯變化，但在48 h時5μg/L處理組CAT活性開始被極顯著誘導（P＜0.01），誘導率為71.8%；隨著暴露時間的延長，各處理組CAT活性顯著上升，誘導率為65.6%、101.0% 和169.0%；3個處理組CAT活性上升程度與PCB153處理質量濃度呈正相關（r2＝0.989 4）。96 h后其活性呈現出不同程度的下降趨勢；1、2μg/L處理組降低到對照組水平之下，均被極顯著抑制（P＜0.01），抑制率為33.0%和13.9%。5μg/L處理組CAT活性有所降低，但仍表現為極顯著誘導（P＜0.01），誘導率為12.5%。由此可見，CAT活性雖然誘導有所延遲，但主要趨勢表現為先誘導后抑制。

2.5 PCB153對半滑舌鰨幼魚MDA含量的影響

由圖3可知，與對照組相比，1μg/L處理組24 h時MDA含量極顯著降低（P＜0.01），降低了29.0%；2、5μg/L處理組MDA含量極顯著升高（P＜0.01），分別增加了12.0%和32.6%。48 h后1μg/L處理組MDA含量繼續(xù)極顯著降低（P＜0.01）；2 μg/L處理組MDA含量仍極顯著升高（P＜0.01）；5μg/L處理組MDA含量恢復至對照組水平。隨暴露時間的延長，72 h后1μg/L處理組MDA含量逐漸恢復到對照組水平；2、5μg/L處理組MDA含量開始呈下降趨勢，表現為極顯著降低（P＜0.01）。96 h后1μg/L處理組MDA含量繼續(xù)上升；2、5μg/L處理組MDA含量仍表現為極顯著降低（P＜0.01）。由此可見，1μg/L處理組MDA含量主要表現為先降低后升高的趨勢，2、5μg/L處理組MDA含量主要表現為先升高后降低。

2.6 PCB153對半滑舌鰨幼魚GST活性的影響

由圖4可知，與對照組相比，1μg/L處理組GST活性在暴露24 h后被顯著抑制（P＜0.05），抑制率為6.76%；2、5μg/L處理組GST活性均被顯著或極顯著誘導，誘導率為8.78%和26.30%。隨著暴露時間的延長，各處理組GST活性繼續(xù)上升，除1μg/L組與對照組仍無顯著差異外，2、5μg/L處理組GST活性達到第一個高峰，誘導率分別為17.3%和50.0%；72 h后各處理組GST活性迅速上升到第二個高峰。96 h后各處理組迅速降低，恢復到對照組水平。由此可見，1μg/L處理組GST活性主要表現為先抑制后誘導的趨勢，2、5μg/L處理組GST活性主要表現為先誘導后抑制。

3 討論

3.1 PCB153半滑舌鰨幼魚的的致死效應及安全質量濃度評價

本研究結果得出，PCB153對半滑舌鰨96 h半致死質量濃度為9.28μg/L。PCBs對斑馬魚（Barchydanio rerio var.）的影響研究中，張鳳君等發(fā)現在PCBs質量濃度為50μg/L水體中，斑馬魚28 d時呈現出了明顯的中毒特征，但未出現死亡個體［11］。PCB153對大型溞（Daphnia magna）LC50-48h為579μg/L［9］。據報道，無脊椎動物對多氯聯(lián)苯的LC50為3.2～2 400.0μg/L，而魚類為1.2～61.0 mg/L［12］。由此可見，不同生物對同一毒物的毒性忍耐力不同，同一生物對不同毒物的忍耐能力也不同；長期暴露于含有PCB153的養(yǎng)殖水環(huán)境中，可能會使許多生物群體造成不同程度的損傷。更嚴重的是，由于PCBs有高度的殘留性，這就有可能通過食物鏈傳遞將PCBs轉移至次級消費者，從而使PCBs逐漸富積，最終對人類產生巨大的危害。有研究表明，含鹵化合物對水生動物毒害作用有較強瞬間毒性和腐蝕性［13］，主要通過其在水體中揮發(fā)出刺激性可溶氣體及其與水中物質化合形成的毒副物質，對水生動物的呼吸中樞、內臟和體表產生刺激傷害引發(fā)，具體的毒性機制還有待進一步研究。

3.2 PCB153對半滑舌鰨幼魚SOD活性的影響

魚體在受到脅迫后，非特異性免疫防御系統(tǒng)會被激活，用來清除異物。SOD作為抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線，是清除陰離子的金屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應生成過氧化氫和氧氣［14］，其基本功能是清除生物體內過高濃度的超氧陰離子自由基。在正常的生理條件下，SOD的生物生成量可及時滿足清除自由基的需要，但在衰老及病態(tài)下，氧自由基的生產與清除則會失去平衡。在本研究中暴露于PCB153的半滑舌鰨SOD活性均顯著性升高，并在48 h達到頂峰，這表明半滑舌鰨在受脅迫初期時，魚體抗氧化防御系統(tǒng)被激活，來提高魚體的免疫功能，是生物對污染的適應性反應。各處理組SOD活性變化幅度與處理液中PCB153質量濃度呈正相關，這與研究大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）暴露于10μg/L多氯聯(lián)苯，其SOD活性結果［15］相一致；而SOD活性的持續(xù)升高對降低PCB153對組織細胞的氧化損傷有一定積極作用，這說明在防御組織氧化損傷方面，SOD活性的升高可能是一種主動的也是有效的途徑［16］。

隨暴露時間的延長，SOD活性呈現先升高后降低的現象，這可能是因為毒物在生物體內低濃度時會導致生物體酶活性升高，而在高濃度時會導致酶活性降低［17］。另外，對劍尾魚的研究表明，暴露48 h后，50μg/L PCBs試驗組的肝組織SOD活性與對照組相比顯著降低（P＜0.05）［18］，這也進一步證明了多氯聯(lián)苯在生物體內的高濃度積累會使SOD活性受到抑制。

本研究還發(fā)現各處理組SOD活性在處理后72 h時均急劇下降，這可能是因為魚類器官組織在受到PCBs重度脅迫時，藥物對動物體的作用已超過機體的適應能力，體內積累過量的活性氧，導致動物體受到傷害［19］。

3.3 PCB153對半滑舌鰨幼魚CAT活性的影響

CAT作用是清除過氧化物酶體內長鏈脂肪酸代謝產生的H2O2［22］，它是機體面臨氧化脅迫時的一個重要代謝途徑。本研究表明，各處理組CAT活性在24 h時，與空白對照組相比無顯著變化；在48 h時5μg/L處理組CAT活性被極顯著誘導（P＜0.01），72 h后各處理組CAT活性均被誘導，其中，2、5μg/L處理組CAT活性被極顯著誘導（P＜0.01）；96 h后CAT活性較72 h時有所降低，其中1、2μg/L處理組均被極顯著抑制（P＜0.01）。

CAT活性表現為先升高后降低趨勢，這與SOD先誘導后抑制的結果相互印證，僅時間上呈現出一種滯后性，分析是由于PCB153脅迫，導致機體內高濃度超氧陰離子不斷產生，在SOD催化下產生大量H2O2，進而機體面臨氧化脅迫而產生高濃度CAT，使得CAT呈現的先誘導后抑制的時間滯后性，也可能是由于半滑舌鰨對PCB153需要一個適應過程，促使CAT活性隨暴露時間延長或SOD分解H2O2含量增多而增加，以增強機體消除活性氧自由基的功能。這與報道恩諾沙星對鯽魚過氧化氫酶活性的影響和鯡（Sprattus）仔魚所得出的CAT活性與多氯聯(lián)苯呈正相關結果［23-24］相一致。

3.4 PCB153對半滑舌鰨幼魚MDA含量的影響

MDA是脂質過氧化作用的典型產物，其含量高低反映了機體細胞受到自由基攻擊的程度［25］。1μg/L處理組MDA含量在24 h時被顯著抑制（P＜0.05），到72 h時恢復與空白對照組相當水平，96 h后被顯著誘導（P＜0.05）；而2、5μg/L處理組MDA含量在24 h時，均被顯著誘導（P＜0.05），48 h時5μg/L處理組MDA含量恢復至與空白對照組相當水平，72 h后2、5μg/L處理組MDA含量與空白對照組相比均被極顯著抑制（P＜0.01），表現出先誘導后抑制作用。符合典型的Hormesis現象［26］，即在低劑量脅迫時表現為有益作用，而在高劑量時表現出負面影響。正如輪蟲在低濃度克百威環(huán)境中繁殖能力較正常環(huán)境中高［27］，這可能是由于1μg/L處理組PCB153剛進入魚體內發(fā)生氧化應激的結果，機體存在自我修復自由基造成氧化損傷的機制，對PCB153帶來的可逆性氧化損傷快速適應的結果。2μg/L和5μg/L組對MDA含量的影響與SOD活性相一致，即先誘導后抑制，這是因為機體組織內過量的超氧陰離子會使過氧化-抗氧化防御系統(tǒng)失衡，引發(fā)脂質過氧化反應產生MDA，導致自由基對生物體系的損傷并使生物膜變性，致使組織破壞和老化，表現為細胞膜破裂，胞質內次級溶酶體大量增加及細胞內脂肪代謝異常。

3.5 PCB153對半滑舌鰨幼魚GST活性的影響

GST是一類催化谷胱甘肽與多種疏水性化合物的親電子基團相連接的Ⅱ相代謝酶［28］，這種連接作用是生物體進行脫毒和排毒的重要方式，具有消除體內自由基和解毒雙重功能［29］，對抗外來物質和氧化代謝副產物。本研究中，在暴露初期，1μg/L處理組GST的活性在暴露24 h后被顯著抑制（P＜0.05），隨著時間延長，48 h后逐漸恢復至對照水平，72 h后被顯著誘導（P＜0.05），說明在短時間內，1μg/L處理組PCB153可顯著抑制GST的活性，而隨時間增長，方可誘導GST活性，這是由于機體暴露于有機污染物時，初期GST活性被抑制時，表示為機體對化學挑戰(zhàn)的特異性反應［30-31］，而后又誘導GST，表明此時已激活細胞防御。

2、5μg/L處理組GST活性在暴露24 h后被顯著誘導（P＜0.01），在72 h時達到最大值，96 h時各處理組GST活性逐漸恢復到初始水平。說明在短時間內，2、5μg/L處理組的PCB153可顯著誘導GST的活性，而隨著暴露時間的延長，魚體體內積累了較多的氧化產物，導致GST活性逐漸受到抑制。這與已報道的研究結果相一致，多種魚暴露于多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴和某些殺蟲劑時，肝GST活性增加［32-33］。虹鱒（Oncorhynchus mykiss）暴露于低含量（＜3 000 ng/g）PCB后［34］，消化盲囊和鰓絲的GST活性均呈激活狀態(tài)，而暴露于高含量（3 000 ng/g），GST活性均先升后降，且鰓絲GST活性變化幅度更顯著。

4 結論

綜上所述，SOD活性被誘導且維持在較高水平；而CAT（1、2μg/L處理組）活性在48 h內始終低于對照組；GST活性雖然與SOD活性變化趨勢相一致，但不如SOD活性波動幅度大；1μg/L處理組MDA含量是先降低后升高，與2、5μg/L處理組MDA含量變化趨勢相反。由此可見，半滑舌鰨SOD對PCB153的敏感性比較強，SOD活性的變化可以作為環(huán)境污染早期預警指標的參考。