陳真真，周國勤，陳金平，謝旭東

（信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南信陽 464000）

果聚糖不僅是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是一種重要的貯藏性碳水化合物。果聚糖水解后產(chǎn)生的單糖具有提高液泡溶質(zhì)濃度、增強植物對多種不良環(huán)境抵抗力的功能［1］。大多數(shù)植物以蔗糖和淀粉作為儲藏物質(zhì)，以果聚糖作為貯藏性碳水化合物的高等植物大部分分布在溫帶和寒帶地區(qū)，比如百合科、禾本科、天門冬科、菊科、桔?？浦参锏龋?］。當(dāng)遇到干旱脅迫時，植物體內(nèi)果聚糖、海藻糖、蔗糖等可溶性糖的積累量通常增多［3］，這些可溶性糖的積累具有降低細胞滲透勢、提高植物抗逆性的功能。果聚糖累積增強植物抗寒性的主因是果聚糖分解釋放出大量游離果糖，可以降低植物組織中水分的冰點，同時這些游離果糖在液泡中累積，可以充當(dāng)液泡的低溫防護劑及滲透緩沖劑［4-5］。

很多研究表明，果聚糖累積有利于增強植物抗逆性。Frossard等研究發(fā)現(xiàn)，黑麥草中果聚糖的合成隨土壤中重金屬含量的升高而增加，說明果聚糖可以增強黑麥草抗毒害能力［6］。Tognetti等的研究表明，在低溫誘導(dǎo)下，冬小麥中抗寒性強品種的果聚糖含量是抗寒性弱品種的3倍左右［7］。Albrecht等研究發(fā)現(xiàn)，漬水持續(xù)脅迫6 d后，小麥根中果聚糖積累量增加了17倍［8］。Kawakami等研究發(fā)現(xiàn)，抗凍性強的小麥品種果聚糖積累量比其他小麥品種多，表明果聚糖的累積可有效提高小麥的抗寒性［9］。

李慧娟等的研究表明，1-SST（蔗糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因）、Ta6-SFT（果聚糖-6-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因）和Ta1-FFT（果聚糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因）在煙草中的表達，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱、抗寒和抗低溫能力［10-12］。植物在逆境條件下會產(chǎn)生大量活性氧類而危及植物正常的生理活動，而抗氧化酶系統(tǒng)能及時清除植物在正常代謝過程中或逆境脅迫下產(chǎn)生的過多超氧化物自由基，以維持細胞內(nèi)有益而無害的低水平活性氧，保護植物細胞免遭氧化損傷?？寡趸赣捎谀軐Ｒ坏厍宄镅趸^程中的超氧化物自由基，因而具有重要的生理調(diào)節(jié)功能。前人通過對不同材料的研究表明，抗氧化酶的活性水平與植物的抗逆性有非常緊密的聯(lián)系。但是，關(guān)于果聚糖合成酶基因與抗氧化酶系統(tǒng)的關(guān)系卻鮮有研究。筆者曾用農(nóng)桿菌浸染法獲得了含有簇毛麥6-SFT基因的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗，在此基礎(chǔ)上，本研究為明確果聚糖酶與抗氧化酶的關(guān)系，擬從生理生化角度探討轉(zhuǎn)果聚糖合成酶基因煙草的抗逆生理機制，為煙草的抗逆性育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)CMM-6-SFT基因煙草，由陜西省植物遺傳工程育種重點實驗室保存，以非轉(zhuǎn)基因煙草W38作為對照。試驗于2016年在西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院進行。

1.2 材料的選取

將由無性繁殖獲得的大小一致的陽性轉(zhuǎn)基因植株移栽至10 cm×10 cm×8 cm塑料盆中。轉(zhuǎn)基因品種和非轉(zhuǎn)基因品種各移栽5株，待植株長至3～5張真葉時，取處理煙草相同部位葉片（從下往上數(shù)第3、4張葉）速凍于液氮中，儲存于-80℃冰箱中備用。

1.3 生理生化指標測定

過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用紫外吸收法，超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用氮藍四唑法，可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250法［13］。每個樣本測3次，各指標用3個測定值的平均值表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件進行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的輸入并作圖，采用SPSS軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因煙草及對照可溶性蛋白含量的比較

由圖1可知，在4℃低溫處理下，轉(zhuǎn)CMM-6-SFT基因煙草和對照可溶性蛋白含量比25℃時均有所提高。在25℃下轉(zhuǎn)基因煙草和對照可溶性蛋白含量相差不大。4℃低溫下轉(zhuǎn)CMM-6-SFT基因煙草可溶性蛋白含量是25℃下的1.96倍，對照可溶性蛋白含量是25℃下的1.17倍。在4℃低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性蛋白含量與對照存在顯著差異。可溶性蛋白與植物的抗寒性密切相關(guān)，在低溫脅迫處理下轉(zhuǎn)基因煙草可溶性蛋白含量顯著提高，由此證明轉(zhuǎn)CMM-6-SFT基因煙草抗寒性明顯提高。

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草及對照CAT活性的比較

由圖2可知，在4℃低溫處理下，轉(zhuǎn)CMM-6-SFT基因煙草和對照CAT活性比25℃下均有所提高。在25℃下轉(zhuǎn)基因煙草和對照CAT活性差異顯著。4℃低溫下轉(zhuǎn)CMM-6-SFT基因煙草CAT活性是25℃下的2.6倍，對照CAT活性是25℃下的2.1倍。在4℃脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的CAT活性與對照存在顯著差異。在低溫逆境脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，形成氧化逆境，由于活性氧的化學(xué)性質(zhì)非常活潑，它所催化的化學(xué)反應(yīng)會對細胞產(chǎn)生嚴重的傷害，因此活性氧的及時清除對植物抗逆性的提高具有重要的意義，由此說明CMM-6-SFT基因的轉(zhuǎn)入增加了煙草的抗逆性。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草及對照POD活性的比較

由圖3可知，在4℃低溫處理下，轉(zhuǎn)CMM-6-SFT基因煙草和對照POD活性均較25℃下有所提高。在25℃下轉(zhuǎn)基因煙草和對照POD活性差異顯著。4℃低溫下轉(zhuǎn)CMM-6-SFT基因煙草POD活性是25℃下的3.24倍，對照POD活性是25℃下的1.67倍。在4℃脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草POD活性與對照存在顯著差異。POD是植物在低溫、干旱和鹽漬等逆境脅迫下的保護酶體系之一，在逆境條件下植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的過氧化氫，從而對植物體產(chǎn)生傷害，而POD可以清除自由基和過氧化物，分解植物體內(nèi)的過氧化氫，避免細胞膜受到傷害，減輕過氧化氫對植物的傷害，由此說明低溫脅迫可導(dǎo)致轉(zhuǎn)CMM-6-SFT基因煙草POD活性增加。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草及對照SOD活性的比較

由圖4可知，在4℃低溫處理下，轉(zhuǎn)CMM-6-SFT基因煙草和對照SOD活性都較25℃下有所提高。在25℃下轉(zhuǎn)基因煙草和對照SOD活性差異顯著。4℃低溫下轉(zhuǎn)CMM-6-SFT基因煙草SOD活性是25℃下的3.01倍，對照SOD活性是25℃下的1.57倍。在4℃脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草SOD活性與對照存在顯著差異。SOD是植物體內(nèi)抵御氧毒害的重要酶之一，低溫脅迫導(dǎo)致煙草產(chǎn)生大量的活性氧，SOD活性的增強使轉(zhuǎn)基因煙草比對照更能及時有效地清除自由基，保護細胞免受活性氧脅迫的傷害。

3 討論與結(jié)論

3.1 果聚糖合成酶基因?qū)扇苄缘鞍踪|(zhì)含量的影響

細胞內(nèi)積累的可溶性蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)可以有效調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的滲透勢，維持水分平衡，從而提高植物的抗逆性，本研究得出，果聚糖合成酶基因的導(dǎo)入提高了煙草中的可溶性蛋白含量，這為抗逆方面的研究提供了重要的理論依據(jù)。別曉敏將抗旱性較強的小麥品種揚麥6號擴增的果聚糖合成酶基因?qū)霟煵葜?，從而使煙草中可溶性糖含量得到極大的提高［14］；高翔等將6-SFT基因?qū)霟煵葜?，使得煙草植株表現(xiàn)出較強的抗旱、抗鹽和抗低溫能力［15］。但到目前為止，還沒有果聚糖酶基因與可溶性蛋白質(zhì)含量關(guān)系的相關(guān)報道。這可能是因為果聚糖基因的導(dǎo)入，誘導(dǎo)了一些新的蛋白生成或使原有蛋白含量明顯增加［16-17］，從而提高煙草的抗逆性。

3.2 果聚糖合成酶基因?qū)AT活性的影響

過氧化氫酶與抗壞血酸過氧化物酶（AsA-POD）一樣，都是清除H2O2的主要酶類，主要存在于植物過氧化物體中，它們的不同之處在于前者不需要還原性底物且具有較高的酶活性效率，但是與H2O2的親和力較弱，后者需要還原性底物，并對H2O2具有較高的親和力。Willekens等的研究表明，過氧化氫酶是C3植物中H2O2清除的關(guān)鍵酶，而且是C3植物耐受脅迫所必需的［18］。但也有研究指出，在植物體中，主要清除H2O2的酶類為抗壞血酸過氧化物酶；雖然過氧化氫酶因不需要ATP和電子供體而成為原核生物中重要的H2O2清除劑，但因其具有釋放O2、定位于植物過氧化物體中和光敏感性等特點，使其在植物抗氧化脅迫中不占重要地位［19］。但無論如何，過氧化氫酶都與植物體內(nèi)的H2O2代謝有密切關(guān)系，能夠減輕H2O2對植物的傷害。本研究中的轉(zhuǎn)基因材料CAT活性都比對照高，由此推測，這些外源基因的導(dǎo)入可以提高植株消除氧自由基傷害的能力，從而減輕細胞膜的損傷，提高煙草的抗逆性。

3.3 果聚糖合成酶基因?qū)OD活性的影響

過氧化物酶具有許多非常重要的生理功能，如參與生長素的降解、木栓質(zhì)和木質(zhì)素的合成、活性氧代謝過程和其他物質(zhì)的氧化過程。除了與植物生長發(fā)育和正常代謝相關(guān)的結(jié)構(gòu)型POD外，很大一部分POD是誘導(dǎo)表達型，這已被大量的脅迫處理試驗和分子水平上的基因調(diào)控研究所證實［20］。李伶俐等在對棉花幼鈴脫落機制進行研究時推測，棉花即將脫落的幼鈴在開花后產(chǎn)生了較多的O-2·，作為應(yīng)激反應(yīng)，幼鈴中的POD活性得到相應(yīng)提高［21］。本研究中轉(zhuǎn)基因材料CAT活性比對照高，由此推測外源基因CMM-6-SFT的導(dǎo)入可以提高植株消除氧自由基傷害的能力，從而減輕細胞膜的損傷，提高煙草的抗逆性。

3.4 果聚糖合成酶基因?qū)OD活性的影響

綜上所述，液泡溶質(zhì)濃度和細胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性是維持細胞正常生命活動的必要條件，但植物在整個生長發(fā)育過程中會受到各種不良環(huán)境的影響，導(dǎo)致細胞膜脂的穩(wěn)定性遭到破壞。植物體內(nèi)存在過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等保護系統(tǒng)，以應(yīng)對來自外界的逆境脅迫［29］。一直以來，培養(yǎng)出抗逆性強的植物，是研究者工作的重中之重。本研究將抗逆性較強的簇毛麥6-SFT果聚糖合成酶基因?qū)霟煵葜?，結(jié)果顯示，煙草葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量、CAT活性、POD活性、SOD活性都比對照有所提高。由此推斷，果聚糖合成酶基因的導(dǎo)入可能會提高煙草的抗逆性。