劉坤 許惠娟 管瑛瑛 陳桓 張福漢 宿杰阿克蘇 侯英勇 許建芳

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)率和高死亡率等特點(diǎn)[1-3]。盡管研究者在膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展方面開(kāi)展了大量研究，目前臨床仍然沒(méi)有有效的治療和早期診斷策略。據(jù)報(bào)道，JMJD1A的表觀遺傳調(diào)控在精子發(fā)生、新陳代謝、性別決定、干細(xì)胞自我更新和分化等生物過(guò)程中起著不同的作用[6-12]。目前，JMJD1A已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，但是在膠質(zhì)瘤中還未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在進(jìn)一步了解JMJD1A在膠質(zhì)瘤增殖侵襲過(guò)程中的作用，期望為膠質(zhì)瘤的診斷治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本收集

收集2016年1—12月復(fù)旦中山醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理科確診為腦膠質(zhì)瘤的10例臨床組織標(biāo)本。

1.2 Western Blot實(shí)驗(yàn)

配制12%分離膠與4%濃縮膠，SDS PAGE電泳1.5小時(shí)，電流為濃縮膠25 mA，分離膠30 mA。轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗4℃過(guò)夜，二抗37℃孵育1小時(shí)，暗室內(nèi)曝光顯影。

1.3 細(xì)胞株及主要試劑

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購(gòu)于中科院上海細(xì)胞生物所；Western-blot抗體購(gòu)于CST公司；MTS試劑盒購(gòu)于Promega公司；Transwell試劑盒購(gòu)于Millipore公司；siRNA購(gòu)于上海吉?jiǎng)P公司。

1.4 細(xì)胞株培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251用10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并加入青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 mg/L），置于37℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞匯合度至70%～90%時(shí)，用DharmaFECT進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)為3組，未處理組細(xì)胞（Mock）加入培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組（siC）加入無(wú)意義序列，JMJD1A干擾組（siJMJD1A）加入JMJD1A特異性干擾序列siRNA。

1.6 MTS增殖實(shí)驗(yàn)

每隔24小時(shí)，每孔加入20ulMTS試劑37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后在490 nm波長(zhǎng)進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

1.7 細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

將500 μL轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備的無(wú)血清懸浮液加入到每個(gè)小室的內(nèi)部（8 μm孔徑），10%FBS的500 μL培養(yǎng)基添加到下層孔內(nèi)。孵育24 h后，穿過(guò)膜的下層膜細(xì)胞用Gimesa染色20 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 JMJD1A在膠質(zhì)瘤組織中顯著過(guò)表達(dá)

通過(guò)Western Blot 方法和搜索 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤中JMJD1A的蛋白和mRNA水平顯著升高（P＜0.01，圖1）。該結(jié)果提示該基因可能參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

2.2 siRNA干擾降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中JMJD1A的表達(dá)

接下來(lái)選取了兩株膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U87和 U251。利用siRNA干擾細(xì)胞中 JMJD1A的表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示，與未處理組細(xì)胞（Mock）和對(duì)照組細(xì)胞（siC）相比，siRNA可顯著降低細(xì)胞中JMJD1A蛋白表達(dá)水平。

2.3 干擾JMJD1A表達(dá)顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力

圖1 膠質(zhì)瘤中JMJD1A蛋白及mRNA水平檢測(cè)

圖2 JMJD1A干擾效率檢測(cè)

圖3 干擾JMJD1A表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖速率的影響

圖4 干擾JMJD1A表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

本研究使用MTS方法檢測(cè)JMJD1A對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。MTS結(jié)果顯示，與未處理組Mock與對(duì)照組siC相比，JMJD1A干擾組細(xì)胞（siJMJD1A）增殖速率顯著降低（P＜0.05，圖3），說(shuō)明JMJD1A下調(diào)可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力。

2.4 干擾JMJD1A表達(dá)顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力

Transwell結(jié)果顯示，與未處理組Mock與對(duì)照組siC相比，JMJD1A干擾組細(xì)胞（siJMJD1A）侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.05，圖4）。結(jié)果說(shuō)明JMJD1A下調(diào)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。

3 討論

膠質(zhì)瘤是死亡率最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。在過(guò)去的十年里，由于腫瘤分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，膠質(zhì)瘤的分型發(fā)生了巨大的變化[1]。目前，膠質(zhì)瘤的治療主要是手術(shù)治療和放化療治療。其中，手術(shù)切除腫瘤通常是首選的治療策略。然而，高級(jí)別膠質(zhì)瘤如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，由于其增殖侵襲等特點(diǎn)，使得手術(shù)不能到達(dá)完全治愈的效果，患者極易復(fù)發(fā)，且預(yù)后很差[2-3]。JMJD1A這種組蛋白去甲基酶，會(huì)參與細(xì)胞表觀遺傳調(diào)控[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)JMJD1A在多種腫瘤中都存在異常表達(dá)并發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤的作用，如前列腺癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌和肉瘤[6-12]。本研究在膠質(zhì)瘤組織中，發(fā)現(xiàn)JMJD1A表達(dá)水平存在顯著增加的現(xiàn)象。通過(guò)siRNA干擾技術(shù)降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中JMJD1A的表達(dá)水平。進(jìn)一步通過(guò)體外分子方法檢測(cè)干擾JMJD1A表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖侵襲的變化。本研究結(jié)果證實(shí)了JMJD1A下調(diào)能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖侵襲能力。本研究可為膠質(zhì)瘤的臨床診斷及治療靶點(diǎn)提供潛在的理論依據(jù)。