孫文利

【關(guān)鍵字】糖基化終產(chǎn)物；腎??；糖尿?。幻嘎?lián)免疫吸附法；血清；蛋白質(zhì)糖基化

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）為全球范圍內(nèi)較為常見的一種慢性基礎(chǔ)性疾病，糖尿病并發(fā)癥已成為導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一。研究證實(shí)，機(jī)體高血糖狀況下，蛋白質(zhì)非酶促糖基化生成的糖基化終產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）致病作用較大[1]，AGEs與糖尿病并發(fā)癥程度有緊密聯(lián)系。糖尿病慢性并發(fā)癥之一則為糖尿病腎病，若早期不接受相應(yīng)診治，疾病發(fā)展到一定階段，AGEs增高。所以，人體心肌、腎臟、血清等組織AGEs指標(biāo)可用來監(jiān)測(cè)糖尿病、糖尿病腎病病情狀況。現(xiàn)納入我院2016年3月—2018年5月收治的40例糖尿病、40例糖尿病腎病和40例健康者重點(diǎn)討論AGEs水平與疾病之間的關(guān)系。具體報(bào)告如下：

1 資料及方法

1.1 一般資料

隨機(jī)從我院2016年3月—2018年5月收治的糖尿病、糖尿病腎病患者中各抽取40例進(jìn)行討論，分別納入糖尿病組、糖尿病腎病組，另選取同時(shí)期到我院體檢健康者40例作為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）40例糖尿病和40例糖尿病腎病患者均接受血糖等檢查確診滿足《2012年糖尿病診療指南》[2]《中國糖尿病診療指南解讀——糖尿病腎病》[3]中糖尿病、糖尿病腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）納入研究前患者均未接受相應(yīng)治療干預(yù)；（3）本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)同意，且患者及其家屬均同意知曉本研究；（4）病歷資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）精神、智力障礙者；（2）中途脫落研究者；（3）合并其他并發(fā)癥者；（4）肝腎、心腦等功能嚴(yán)重異常者。對(duì)照組：男性22例，女性18例，年齡36～78歲，平均為（56.3±1.2）歲；糖尿病組：男性23例，女性17例，年齡35～79歲，平均為（56.7±1.1）歲；糖尿病腎病組：男性22例，女性18例，年齡36～78歲，平均為（56.7±1.1）歲。各組患者基本資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

制備抗原：將核糖核酸酶25 g、牛血清白蛋白50 g加入到葡萄糖1 mol/L中，溶于磷酸鹽緩沖液0.2 mol/L中，用微量過濾器濾除細(xì)菌，37℃環(huán)境下，孵育3個(gè)月。并制備糖化牛血清白蛋白（AGE-BSA）、糖基化終末產(chǎn)物（AGE-RNase）。用磷酸鹽緩沖液0.01 mol/L，透析72小時(shí)，并將未結(jié)合的葡萄糖去除。用熒光分光光度計(jì)（RF-540/V4.0型）測(cè)定AGEs熒光值，發(fā)射波長為440 nm，激發(fā)波長為370 nm。

制備抗AGEs抗體：充分乳化弗氏不完全佐劑2 mL和AGERNase 20 g/L，用兔子做實(shí)驗(yàn)對(duì)象，多點(diǎn)注射，每間隔1周注射1次，共注射4次。最后一次注射后，實(shí)施加強(qiáng)免疫，持續(xù)8～10 d，抽取靜脈血，抗體效價(jià)用瓊脂雙向擴(kuò)散法測(cè)定。如效價(jià)低，則實(shí)施一次加強(qiáng)免疫。直至抗體效價(jià)理想時(shí)，抽取其頸動(dòng)脈血液，分離血清，將其放置于零下20℃環(huán)境下備用。

抽取3組研討對(duì)象空腹靜脈血液5 mL，離心處理后，分離血清，并將其放置在零下20℃環(huán)境中保存，用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定其血清AGEs指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)判定

本研究中各檢驗(yàn)均由我院檢驗(yàn)科專業(yè)且工作經(jīng)驗(yàn)豐富的2名醫(yī)生負(fù)責(zé)，若發(fā)生意見分歧，則商討確定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0版本分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

比較3組研討對(duì)象AGEs指標(biāo)，DM組、DN組高于對(duì)照組，DN組高于DM組，組間數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

3 討論

蛋白質(zhì)糖基化也稱羰氨反應(yīng)（Maillard反應(yīng)）[4]，非酶參與狀況下，葡萄糖可自發(fā)結(jié)合蛋白質(zhì)游離氨基，生成阿美多米（Amadori）物質(zhì)，此物質(zhì)經(jīng)相應(yīng)轉(zhuǎn)變后可生成不可逆AGEs，發(fā)生蛋白質(zhì)交聯(lián)，干擾其功能、結(jié)構(gòu)，與特異性受體一起對(duì)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活化功效，激活轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)釋放和合成生長因子，氧化應(yīng)激受到誘導(dǎo)，進(jìn)而損傷組織細(xì)胞。目前已知糖尿病、糖尿病腎病患者組織、血清中AGEs指標(biāo)明顯增高，血清AGEs指標(biāo)上升的原因可能為腎臟清除功能減少和生成多導(dǎo)致。AGEs為混合物，多樣性結(jié)構(gòu)，所以，檢測(cè)組織和血清中AGEs指標(biāo)有一定難度?，F(xiàn)臨床所使用的檢測(cè)方式均具有一定缺陷性[5]，如準(zhǔn)確性不高、設(shè)備條件要求高、無法廣泛推廣等。本研究中采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)，利用固相抗原與待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合來反應(yīng)AGEs水平。相比與其他方式，此方式具有精確性好、特異性高、成本低、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，且可在普通實(shí)驗(yàn)室使用[6-7]。目前用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定AGEs指標(biāo)，可實(shí)現(xiàn)普查糖尿病、糖尿病腎病的目的，以早期診治疾病，并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)病和并發(fā)癥狀況[8-9]。但因人們生活方式和飲食習(xí)慣不同，目前仍然無法測(cè)定健康人群AGEs標(biāo)準(zhǔn)范圍。研究報(bào)告指出，AGEs生成量與葡萄糖濃度有一定關(guān)系，血糖濃度正常狀況，AGEs生成速度較為緩慢[10-11]。但若血糖指標(biāo)增高時(shí)，AGEs生成速度顯著增快，所以，糖尿病患者體中則大量蓄積AGEs[12-13]。而人體體內(nèi)循環(huán)時(shí)，多由腎臟清除AGEs，研究表明，糖尿病腎病患者AGEs水平顯著高于糖尿病患者，而給予血液透析是否可降低AGEs水平，目前暫無明確定論。

表1 比較3組研討對(duì)象AGEs指標(biāo)（±s）

表1 比較3組研討對(duì)象AGEs指標(biāo)（±s）

注：與對(duì)照組比較，#t=20．489 2，*t=31．281 3，#P=0．000 0，*P=0．000 0；與 DN 組比較，#t=10．678 9，#P=0．000 0

組別 例數(shù) AGEs（mg/L）DM 40 21．23±6．21#DN 40 33．12±9．32*對(duì)照組 40 10．62±3．11

綜上所述，經(jīng)分析后得知，AGEs指標(biāo)在診斷糖尿病、糖尿病腎病中有一定作用，但臨床還需綜合其他診斷指標(biāo)進(jìn)行確診，以確保診斷準(zhǔn)確性。