王鵬雁, 王昌明，鄭增光

(1浙江醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 浙江 杭州 310013； 2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸科， 廣西 桂林 541001； 3浙江省腫瘤醫(yī)院病理科， 浙江 杭州 310022)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是常見的慢性疾病，其主要病理特征為炎癥反應(yīng)和血管重塑。作為肺血管重塑的主要效應(yīng)細(xì)胞，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)在炎癥和創(chuàng)傷等刺激下具有合成和分泌功能[1-2]。Toll 樣受體(Toll-like receptors, TLRs)可特異性識(shí)別多種病原成份，啟動(dòng)固有免疫反應(yīng)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。有研究顯示[3]，在哮喘的氣道重塑中TLR4信號(hào)通道可以調(diào)控支氣管平滑肌細(xì)胞合成并分泌炎癥因子；本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)研究表明[4]，TLR4表達(dá)水平與COPD大鼠PASMCs合成和分泌功能有關(guān)，但其機(jī)制仍不清楚。白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase, IRAK)家族是TLR與白細(xì)胞介素1受體信號(hào)通路中重要分子，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)控制和炎癥反應(yīng)。故本課題通過(guò)利用IRAK抑制劑為工具藥，探討其對(duì)LPS(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的COPD大鼠PASMCs分泌功能的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)Wistar大鼠36只，體重(200±20)g，周齡8～10周，來(lái)自桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為SCXK(桂)2013-0001。

2 主要試劑和儀器

脂多糖購(gòu)自Sigma；紅色果樹香煙(貴陽(yáng)卷煙廠出品，煙氣煙堿量1.2 mg；焦油量15 mg)；澳洲進(jìn)口胎牛血清和DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)；抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA、IRAK-1和p-IRAK-1兔單克隆抗體 (Abcam)；抗β-actin鼠單克隆抗體(中國(guó)中杉金橋公司)；總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；大鼠血小板源性生長(zhǎng)因子AB(platelet-derived growth factor-AB,PDGF-AB)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6) ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物公司)。自制煙熏有機(jī)玻璃艙(規(guī)格91 cm×42 cm×62 cm)；細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Memmer INC108)；倒置相差顯微鏡和熒光倒置顯微鏡(Olympus)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀和蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1COPD大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建 在實(shí)驗(yàn)中心取健康SPF 級(jí) Wistar大鼠36只，雌雄各半，適應(yīng)環(huán)境(溫度一般維持22 ℃～25 ℃，濕度保持60%左右，正常飲水、進(jìn)食)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照(control)組和COPD模型(COPD)組，各18只；COPD模型組大鼠于實(shí)驗(yàn)第1和14天經(jīng)氣道內(nèi)注入LPS(濃度為1 mg/L)每次200 μg，予自制有機(jī)玻璃艙內(nèi)煙熏2 h/d，上、下午各1次，每次約8～10支煙，共 8周。空白對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)第1和14天經(jīng)氣道注入等量生理鹽水，不做其它干預(yù)，與COPD模型組大鼠同等條件(溫度、濕度、避光強(qiáng)度)飼養(yǎng)8周。

3.2HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變 8周后，各組隨機(jī)取3只大鼠，予10%水合氯醛(30～40 mL/kg)從腹腔注射麻醉大鼠，取出肺組織，予4%多聚甲醛溶液將其固定24 h后，進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，HE染色，顯微鏡下觀察各組肺組織病理學(xué)改變及測(cè)定肺動(dòng)脈管壁厚度占外徑的百分比(WT%)和管壁面積占血管總面積的百分比(WA%)。

3.3PASMCs的分離、培養(yǎng) 及鑒定 將COPD模型組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(30～40 mL/kg)麻醉，放入75%乙醇浸泡5 min，開胸取出心肺組織，分離肺動(dòng)脈3 級(jí)以下分支，放入含PBS溶液的培養(yǎng)皿中用鑷子分離出中膜平滑肌層。將中膜組織剪成2 mm×2 mm×2 mm小塊，加入I型膠原酶(濃度為0.2%)37 ℃水浴消化15～20 min，吸出消化酶，加入DMEM高糖培養(yǎng)液(含25%胎牛血清)，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 d左右細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)培養(yǎng)瓶的90%以上時(shí)進(jìn)行消化傳代，采用顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及α-SMA免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。

3.4Western blot檢測(cè)各組PASMCs中IRAK-1蛋白的表達(dá)水平 將對(duì)照(control)組、LPS組(終濃度為1 mg/L)、IRAK-1/4抑制劑(終濃度為10 μmol/L)組和LPS+IRAK-1/4抑制劑組(以10 μmol/L IRAK1/4抑制劑預(yù)處理30 min后加入LPS，終濃度為1 mg/L)PASMCs均培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞，提取總蛋白，檢測(cè)濃度后計(jì)算上樣量，在聚丙烯酰胺凝膠泳道中加入3 μL Marker及20 μL的樣品組(每孔所含蛋白量統(tǒng)一)進(jìn)行分離(濃縮膠時(shí)電壓為80 V，60 min, 在分離膠時(shí)為 120 V，30 min)，濕式轉(zhuǎn)膜(不同分子量則不同的轉(zhuǎn)膜時(shí)間)，取出PVDF 膜，加封閉液搖床溫育2 h，加入抗IRAK-1和p-IRAK-1兔單克隆抗體 (稀釋濃度分別為1∶500和1∶1 000)及抗β-actin鼠單克隆抗體(稀釋濃度1∶1 000)，4 ℃搖床過(guò)夜，次日棄 I 抗，予TBST洗3次，每次10 min,加 II 抗溫育1 h(II抗稀釋濃度為1∶5 000), 棄 II 抗，予TBST洗3次；每次10 min,加入發(fā)光液(A∶B=1∶1)，采用ECL超敏發(fā)光儀采集圖像，Sensi Ansys 凝膠圖像分析軟件分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5ELISA方法檢測(cè)各組PASMCs培養(yǎng)上清中PDGF-AB和IL-6的含量 將對(duì)照組、LPS組、IRAK-1/4抑制劑組和LPS+IRAK-1/4抑制劑組PASMCs均培養(yǎng)48 h后收集上清液，根據(jù)PDGF-AB和IL-6 ELISA反應(yīng)試劑盒嚴(yán)格操作，在酶標(biāo)儀上設(shè)定波長(zhǎng)為450 nm時(shí)，測(cè)各孔的吸光度(A)值，以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的A值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，根據(jù)相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入樣品A值即計(jì)算出濃度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩個(gè)樣本組間差異采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間比較使用單因素方差分析，兩兩比較方差齊用SNK法，方差不齊時(shí)用Games-Howell法；相關(guān)性分析采用Pearson correlation檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺組織病理形態(tài)學(xué)改變的觀察

空白對(duì)照組無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)完整。COPD模型組大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁斷裂、肺大泡形成，肺動(dòng)脈平滑肌層增厚,見圖1。圖像分析結(jié)果表明,COPD模型組肺動(dòng)脈出現(xiàn)明顯重構(gòu)，其WT%和WA%均高于空白對(duì)照組(P<0.01)，見表1。

Figure 1.Lung tissue HE staining in rats (×100).

圖1大鼠肺組織HE染色

表1大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈HE染色測(cè)定WT%和WA%

Table 1.Determination of WT% and WA% by HE staining of distal pulmonary artery in rats (Mean±SD.n=3)

GroupWT%WA%Control 0.284±0.0190.436±0.041COPD0.441±0.094??0.711±0.096??

**P<0.01vscontrol group.

2 COPD大鼠PASMCs光鏡觀察及α-SMA蛋白的表達(dá)

PASMCs呈梭形、聚團(tuán)生長(zhǎng)，當(dāng)層數(shù)增多，重疊堆積成“峰-谷”狀，見圖2A。α-SMA免疫熒光染色，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞質(zhì)α-SMA蛋白染成紅色，胞質(zhì)中有向細(xì)胞兩極呈放射狀分布的條絲狀物，與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行，形態(tài)清晰，故認(rèn)定該細(xì)胞為PASMCs，見圖2B。

3 Western blot檢測(cè)各組PASMCs中IRAK-1蛋白的表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，LPS組IRAK-1磷酸化蛋白表達(dá)水平升高，IRAK-1非磷酸化蛋白表達(dá)下降(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+IRAK-1/4抑制劑組IRAK-1磷酸化蛋白表達(dá)明顯降低，IRAK-1非磷酸化蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖3。

4 ELISA方法檢測(cè)各組PASMCs分泌PDGF-AB和IL-6的含量

與對(duì)照組相比，LPS組的PDGF-AB和IL-6含量升高(P<0.05)；予10 μmol/L IRAK1/4 抑制劑預(yù)處理 30 min后，再給予相同濃度LPS刺激，較單純LPS組，其PDGF-AB和IL-6含量顯著下降(P<0.05)，見表2。

Figure 2.Light microscopicobservation of PASMCs (A) and immunofluorescence staining of α-smooth muscle actin in the PASMCs (B).

圖2PASMCs光鏡觀察及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞免疫熒光染色

Figure 3.The effect of IRAK-1/4 inhibitor on IRAK-1 protein expression in PASMCs of COPD rats. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

圖3IRAK-1/4抑制劑對(duì)COPD大鼠PASMCs上IRAK-1蛋白表達(dá)的影響

表2予IRAK1/4抑制劑處理后COPD大鼠PASMCs分泌因子水平的變化

Table 2.The levels of PDGF-AB and IL-6 in culture supernatants of the PASMCs from COPD rats after IRAK-1/4 inhibitor treatment (ng/L. Mean±SD.n=3)

GroupPDGF-ABIL-6Control55.38±5.8791.66±6.78LPS82.39±1.35?489.57±17.52??IRAK-1/4 inhibitor50.29±0.77##73.90±3.60##LPS+IRAK-1/4 inhibitor62.42±1.97#81.24±0.65##

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

5 IRAK-1磷酸化蛋白表達(dá)水平與COPD大鼠PASMCs分泌PDGF-AB和IL-6濃度的相關(guān)性分析

COPD大鼠PASMCs IRAK-1磷酸化表達(dá)水平與細(xì)胞上清液中PDGF-AB和IL-6的濃度呈正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r分別為0.875和0.949，P<0.05)。

討 論

COPD是一種慢性疾病，嚴(yán)重影響患者的生存率和死亡率，成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)早期無(wú)缺氧的COPD肺組織已有明顯的血管炎癥改變及結(jié)構(gòu)重建，且肺動(dòng)脈高壓與COPD預(yù)后密切相關(guān)[5]。PASMCs不僅僅是肺血管重塑的主要效應(yīng)細(xì)胞，而且扮演著免疫細(xì)胞的作用，合成分泌炎癥介質(zhì)促進(jìn)血管炎癥的發(fā)展[1-2]，因此PASMCs在肺血管重塑中起著重要的作用，但潛在機(jī)制尚不完全清楚。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)下COPD大鼠PASMCs合成分泌功能與TLR4表達(dá)存在時(shí)間及劑量-效應(yīng)關(guān)系，且呈正相關(guān)[4]。但I(xiàn)RAK是否參與調(diào)控COPD大鼠PASMCs分泌PDGF-AB和IL-6尚不清楚。

IRAK是細(xì)胞內(nèi)激酶，有多個(gè)區(qū)域蛋白，包括N末端死亡域和C末端中央激酶域[6]。哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)IRAKs家族4個(gè)成員是IRAK-1、IRAK-2、IRAK-4和IRAK-M。IRAK-M的表達(dá)僅限于巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，而IRAK-1、IRAK-2和IRAK-4則被廣泛地表達(dá)[7]。IRAK家族可激活多條信號(hào)通路，主要包括NF-κB、MAPKs和IFN調(diào)節(jié)因子在內(nèi)的信號(hào)通路。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)予IRAK抑制劑處理后，大鼠頸總動(dòng)脈損傷模型組的TLR4蛋白表達(dá)水平和IRAK、IκB磷酸化蛋白表達(dá)水平明顯降低，且部分炎癥因子如IL-β和TNFα的表達(dá)水平也顯著降低，進(jìn)而減少大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖及新生內(nèi)膜的形成[8]。同樣，在Toll樣受體激活的反應(yīng)中，IRAK1基因敲除小鼠細(xì)胞因子的產(chǎn)量較對(duì)照組明顯減少[9]；IRAK4基因敲除小鼠對(duì)TLR激活甚至沒有反應(yīng)[10],以上說(shuō)明IRAK-1和IRAK-4是Toll樣受體與IL-1受體信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要因子，其磷酸化激活在全身炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色。

PDGF主要由單核/巨噬細(xì)胞合成，研究發(fā)現(xiàn)[11]PDGF可促進(jìn)肌纖維母細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維，上調(diào)組織金屬蛋白酶抑制劑抑制膠原酶的作用，以減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解,說(shuō)明PDGF與血管重塑密切相關(guān)。IL-6是一種細(xì)胞因子，主要由纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，可通過(guò)多條信號(hào)通路，參與免疫細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)血管生成[12]。以上研究表明PDGF和IL-6可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)展及血管重塑。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建COPD大鼠模型，分離培養(yǎng)原代PASMCs，利用IRAK1/4抑制劑為工具藥，采用Western blot檢測(cè)IRAK1的蛋白水平，ELISA檢測(cè)炎癥因子濃度，以探討IRAK-1表達(dá)水平與COPD大鼠PASMCs分泌PDGF-AB和IL-6的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，LPS刺激COPD大鼠PASMCs 后，PASMCs中IRAK-1磷酸化蛋白水平及PDGF-AB和IL-6的表達(dá)明顯升高；予IRAK1/4抑制劑干擾后，PASMCs中IRAK-1磷酸化蛋白表達(dá)及PDGF-AB和IL-6的表達(dá)顯著降低；同時(shí)，Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)PASMCs IRAK-1磷酸化水平與細(xì)胞上清液中PDGF-AB和IL-6的濃度呈正相關(guān)性，說(shuō)明細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，PASMCs中IRAK-1很少磷酸化，予LPS刺激后，PASMCs中IRAK-1磷酸化蛋白表達(dá)明顯升高，從而促進(jìn)PASMCs分泌炎癥介質(zhì)細(xì)胞因子，加重COPD病情進(jìn)展，阻斷IRAK1/4可抑制PASMCs分泌炎癥介質(zhì)細(xì)胞因子，減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述, 我們發(fā)現(xiàn)IRAK-1參與LPS誘導(dǎo)下COPD大鼠PASMCs分泌PDGF-AB和IL-6，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)及肺血管重塑。故后續(xù)工作擬行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以IRAK-1/4為干預(yù)靶點(diǎn)，探討防治COPD肺血管重塑的有效措施。