李德榮，劉云龍，王 翔，孫 焱，康玨寧，劉 權(quán)， 何子奇，陶芝偉，關(guān)曉峰，鄧耀良, 2△

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院泌尿外科, 2附屬瑯東醫(yī)院泌尿外科， 廣西 南寧 530021)

草酸鈣腎結(jié)石以其高發(fā)病率和高復(fù)發(fā)率被研究者重視[1-2]，然而到目前為止，草酸鈣腎結(jié)石形成的機(jī)制仍不明確。研究表明，自噬在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用[3-4]。自噬是一種在營(yíng)養(yǎng)缺乏和氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定方面發(fā)揮重大作用。自噬已廣泛涉及腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病及衰老等多種病理生理過程[5-6]。自噬在疾病過程中的作用越來越引起人們的關(guān)注，然而，自噬在腎結(jié)石形成中的作用仍不明確。本研究擬通過乙二醇誘導(dǎo)建立大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型，首先檢測(cè)大鼠腎臟內(nèi)自噬水平的變化，然后通過應(yīng)用自噬調(diào)節(jié)劑和抗氧化劑，探討自噬在大鼠草酸鈣腎結(jié)石形成中的作用及其機(jī)制，為草酸鈣腎結(jié)石的防治提供新的策略。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

40只雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)SCXK(桂)2014-0002。

2 主要試劑

氯喹(chloroquine,Chlo)、雷帕霉素(rapamycin,Rapa)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)(Sigma)；兔抗LC3B多克隆抗體(Cell Signaling Technology)；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒和鈣鹽染色Von Kossa硝酸銀法(北京索萊寶)；總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)試劑盒和谷胱甘肽過氧物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒(南京建成)；大鼠腎損傷分子1 (kidney injury molecule 1，Kim-1)和大鼠中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL) ELISA試劑盒(武漢華美生物)。

3 方法

3.1動(dòng)物分組 按完全隨機(jī)法分5組，每組8只：正常對(duì)照(normal control, NC)組(正常飲食)；結(jié)石模型(model)組(自由飲用0.75%乙二醇溶液)；雷帕霉素處理(Rapa)組(自由飲用0.75%乙二醇溶液+腹腔注射雷帕霉素溶液 0.25 mg·kg-1·d-1)；氯喹處理(Chlo)組(自由飲用0.75%乙二醇溶液+腹腔注射氯喹溶液 60 mg·kg-1·d-1)；NAC處理(NAC)組(自由飲用0.75%乙二醇溶液+腹腔注射NAC溶液 150 mg·kg-1·d-1)，均連續(xù)喂養(yǎng)4周。

3.2標(biāo)本的采集與處理 4周后使用代謝籠收集24 h尿液，檢測(cè)尿液中腎損傷因子Kim-1及NGAL的水平。用4%水合氯醛麻醉小鼠，下腔靜脈取血(不抗凝)，離心后取血清檢測(cè)肌酐及尿素氮含量。其次，用生理鹽水進(jìn)行原位腎臟灌注沖洗，取右腎，縱行剖開，一半浸泡在4%的多聚甲醛液中用于石蠟切片做病理分析，將另一半腎組織用于電鏡檢測(cè);左腎做標(biāo)記后移入-80 ℃冰箱保存。

3.3Western blot檢測(cè)各組腎臟自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá) 從腎組織提取蛋白，BCA定量，等量蛋白樣本上樣，SDS-PAGE分離蛋白，以濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移后用脫脂奶粉溶液將PVDF膜封閉，加入 I 抗 (1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加人 II 抗(1∶2 000)室溫反應(yīng)1 h，TBST洗膜，曝光顯影，用ImageJ分析LC3-II蛋白表達(dá)情況。

3.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組腎臟自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá) 4 μm厚石蠟切片，60 ℃恒溫烘烤，脫蠟和水化，枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)高壓熱修復(fù)，3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物，山羊血清封閉，加 I 抗4 ℃過夜，37 ℃復(fù)溫， 加 II 抗37 ℃孵育1 h，DAB染色，避光，蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化，PBS返藍(lán)，封片。對(duì)染色結(jié)果用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行分析，測(cè)定各組LC3-II陽性反應(yīng)物平均吸光度。

3.5透射電鏡觀察各組腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化 取各組腎組織，切成1 mm×1 mm ×1 mm大小的組織塊，置于2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃ 避光固定2 h，后用PBS液沖洗3次，電鏡室制片進(jìn)行透射掃膜，觀察各組腎組織內(nèi)自噬泡的數(shù)量。

3.6鈣鹽染色法檢測(cè)各組腎臟鈣鹽沉積水平 選厚度5 μm石蠟切片，操作過程嚴(yán)格按鈣鹽染色試劑盒(Von Kossa硝酸銀法)說明書進(jìn)行。結(jié)果觀察鈣鹽呈黑褐色或深黑色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。對(duì)鈣鹽沉積進(jìn)行半定量分析，分為6級(jí)評(píng)判：鈣鹽沉積<1個(gè)記為0分；1個(gè)≤鈣鹽沉積≤10個(gè)記為1分；10個(gè)<鈣鹽沉積≤30個(gè)記為2分；30個(gè)<鈣鹽沉積≤50個(gè)記為3分；50個(gè)<鈣鹽沉積≤75個(gè)記為4分；76個(gè)≤鈣鹽沉積記為5分。

3.7酶標(biāo)法檢測(cè)各組T-SOD和GSH-Px抗氧化酶活力 用酶標(biāo)法檢測(cè)尿液T-SOD和GSH-Px活力，操作過程嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

3.8腎損傷因子Kim-1和NGAL的檢測(cè) 收集24 h尿液，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)各組尿液中NGAL及Kim-1水平，具體步驟按照說明書進(jìn)行。

3.9血清中尿素氮和肌酐的檢測(cè) 全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中尿素氮及肌酐值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q法檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠腎組織自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)的變化

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組對(duì)比，結(jié)石模型組大鼠腎臟中自噬相關(guān)蛋白 LC3-II 表達(dá)顯著增高(P<0.05)；與結(jié)石模型組對(duì)比，雷帕霉素處理組和氯喹處理組大鼠腎臟自噬相關(guān)蛋白 LC3-II 明顯升高(P<0.05)，而 NAC 處理組大鼠腎臟中的 LC3-II 蛋白則降低(P<0.05),見圖1。

Figure 1.Comparison of LC3-II/LC3-I in the rats with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

圖1Westernblot檢測(cè)各組大鼠腎臟中LC3-II的表達(dá)水平

2 免疫組化檢測(cè)各組大鼠腎臟LC3表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組對(duì)比，結(jié)石模型組大鼠腎臟中LC3-II表達(dá)較正常組明顯增多(P<0.05)；與結(jié)石模型對(duì)比，雷帕霉素處理組及氯喹處理組LC3-II表達(dá)增多，而 NAC 處理組大鼠腎臟中 LC3-II表達(dá)減少(P<0.05),見圖2。

Figure 2.The expression of LC3-Ⅱ in the renal tissues of rats with different treatments detected by immunohistochemical staining (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

圖2免疫組化檢測(cè)LC3-Ⅱ在各組大鼠腎組織中的表達(dá)情況

3 電鏡觀察各組腎臟內(nèi)自噬泡的變化

與正常組相比，結(jié)石模型組大鼠腎臟可見線粒體腫脹及自噬泡；與結(jié)石組對(duì)比，雷帕霉素處理組和氯喹處理組大鼠腎臟內(nèi)自噬泡數(shù)量顯著增多(P<0.05),而NAC處理組大鼠腎臟內(nèi)自噬泡數(shù)量明顯減少(P<0.05)；與正常組和氯喹處理組對(duì)比，雷帕霉素處理組和結(jié)石模型組大鼠腎臟內(nèi)的線粒體可見明顯的腫脹,見圖3。

Figure 3.Observation of autophagic vacuoles in renal tissue under transmission electron microscope. The scale bar=1 μm. Yellow and red arrows indicated autophagosomes and autolysosomes, respectively. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

圖3電鏡下觀察各組大鼠腎組織中自噬泡的變化

4 抗氧化酶GSH-Px和T-SOD活性的變化

與正常組對(duì)比，結(jié)石模型組抗氧化酶GSH-Px和T-SOD活性均下降；與結(jié)石模型組對(duì)比，雷帕霉素處理組抗氧化酶GSH-Px和T-SOD活性均下降，而NAC處理組和氯喹處理組大鼠抗氧化酶GSH-Px和T-SOD活性增高(P<0.05),見圖4。

Figure 4.The changes of total superoxide dismutase (T-SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in the urine of different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

圖4各組尿液中T-SOD和GSH水平的變化

5 血清肌酐和尿素氮含量的變化

同正常組對(duì)比，結(jié)石模型組血清肌酐及尿素氮含量明顯增高(P<0.05)；與結(jié)石模型組對(duì)比，雷帕霉素處理組血清肌酐和尿素氮含量更高(P<0.05)；而氯喹處理組和NAC處理組血清肌酐和尿素氮含量則比結(jié)石模型組低(P<0.05)。與NAC處理組對(duì)比，氯喹處理組血清肌酐和尿素氮含量均有所下降,見圖5。

Figure 5.The changes of blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) in different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

圖5各組血清中BUN和SCr水平的變化

6 腎損傷因子Kim-1和NGAL的變化

同正常組對(duì)比，結(jié)石模型組尿液中的腎損傷因子NGAL和Kim-1水平均明顯增高(P<0.05)；與結(jié)石模型組對(duì)比，雷帕霉素處理組的NGAL和Kim-1水平均明顯增高(P<0.05)，而氯喹處理組和NAC處理組則降低(P<0.05)，這與血清肌酐和尿素氮含量的變化趨勢(shì)相似。與NAC處理組對(duì)比，氯喹處理組腎損傷因子Kim-1和NGAL水平均有所下降,見圖6。

Figure 6.The changes of kidney injury molecule 1 (Kim-1) and neutrophil geitinase-associated lipocalin (NGAL) in the urine of different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

圖6各組尿液中Kim-1和NGAL水平的變化

7 腎臟晶體沉積的變化

通過鈣鹽染色我們得出，在正常大鼠腎臟內(nèi)無晶體沉積；在結(jié)石模型組中，我們觀察到腎小管擴(kuò)張和晶體沉積; 與結(jié)石模型組對(duì)比，雷帕霉素處理組腎小管管腔內(nèi)晶體沉積數(shù)量增多而且腎小管管腔擴(kuò)張更明顯，而氯喹處理組和NAC處理組晶體沉積和組織病理學(xué)變化有所改善；與NAC處理組對(duì)比，氯喹處理組晶體沉積數(shù)量更少，見圖7。

討 論

我們的前期研究表明，晶體-細(xì)胞反應(yīng)在草酸鈣腎結(jié)石的形成機(jī)理中起到了重要的作用[7-8],然而，其具體的作用機(jī)制仍不明確。新近的研究發(fā)現(xiàn)，自噬在許多腎臟疾病中扮演了重要角色[3-4]。自噬是真核細(xì)胞內(nèi)一種依賴溶酶體來降解胞內(nèi)損傷的細(xì)胞器和變質(zhì)蛋白質(zhì)，并使降解產(chǎn)物被重新利用的過程，它可對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)育、成熟分化及死亡進(jìn)行調(diào)控，適度自噬可對(duì)機(jī)體有利，過度自噬對(duì)機(jī)體則可引起機(jī)體損傷[9]。炎癥、免疫疾病、缺氧及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS) 等多種因素均可誘導(dǎo)自噬[10-12],而炎癥和 ROS 又在結(jié)石的形成過程中扮演著重要的作用[13-14]。此外，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，ROS介導(dǎo)的自噬可以加重CaOx晶體誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷[15]。因此，我們推測(cè)自噬在草酸鈣腎結(jié)石的形成過程中發(fā)揮著重要的作用。

Figure 7.The results of Von Kossa staining (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

圖7鈣鹽染色結(jié)果的比較

為證實(shí)該假設(shè)，本研究擬通過乙二醇誘導(dǎo)建立大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型，并分別應(yīng)用自噬調(diào)節(jié)劑雷帕霉素和氯喹及抗氧化劑NAC進(jìn)行干預(yù)，通過Western blot、免疫組化及電鏡觀察檢測(cè)各組腎臟中自噬關(guān)鍵蛋白LC3-II表達(dá)水平和自噬泡的數(shù)量，從而評(píng)價(jià)各組大鼠腎臟內(nèi)自噬水平的變化。通過檢測(cè)各組腎臟內(nèi)T-SOD和GSH-Px 的水平，來探討自噬的激活是否由ROS介導(dǎo)。鈣鹽染色評(píng)價(jià)腎臟內(nèi)晶體的沉積情況，通過檢測(cè)血清肌酐和尿素氮含量、尿液KIM-1和NAGL的水平來反映腎臟的損傷程度。

微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3， MAP1-LC3，LC3)定位于自噬泡膜表面并參與自噬泡構(gòu)成，未發(fā)生自噬時(shí)以I型LC3存在，當(dāng)發(fā)生自噬I型LC3發(fā)生改變，形成LC3 II，其數(shù)量與自噬泡數(shù)量呈正相關(guān)，LC3-II表達(dá)量可一定程度上反映自噬水平，因此Western blot及免疫組化檢測(cè)腎臟自噬相關(guān)蛋白LC3是觀察自噬現(xiàn)象較為可靠的生物學(xué)標(biāo)志物[16]。透射電鏡是檢測(cè)自噬體和自噬溶酶體形成的金指標(biāo)，在電鏡下可見自噬體是300～500 nm大小月牙型或杯口型雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)其與溶酶體結(jié)合后變成單層膜的自噬溶酶體[17]。此外，SOD和GSH是ROS的清除劑，當(dāng)ROS升高，SOD和GSH因消耗ROS而降低，可以間接定性反映體內(nèi)ROS水平?？寡趸瘎㎞AC是谷胱甘肽合成前體，NAC具有抗氧化能力，可干擾自由基的產(chǎn)生和清除已生成的自由基[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，大鼠草酸鈣結(jié)石模型組腎組織中自噬泡的數(shù)量增多、LC3-II表達(dá)增高、SOD和GSH活性下降、腎臟內(nèi)晶體沉積增加，從而表明乙二醇不僅可以誘導(dǎo)大鼠草酸鈣腎結(jié)石的形成，而且可以激活腎臟內(nèi)自噬和ROS的產(chǎn)生。與結(jié)石模型組相比，雷帕霉素處理組和氯喹處理組中自噬水平均增加，其中，雷帕霉素處理組中ROS水平和晶體沉積進(jìn)一步增加，而氯喹處理組則相反。在NAC處理組中自噬與ROS水平均下降，并且晶體沉積減少。因此，我們推斷ROS介導(dǎo)的自噬促進(jìn)了草酸鈣腎結(jié)石的形成，而抑制自噬則能夠有效地降低乙二醇誘導(dǎo)腎臟內(nèi)晶體的沉積。

Kim-1 是一種敏感性和特異性都較高的早期診斷腎小管損傷的標(biāo)志物，在評(píng)價(jià)急性腎損傷患者疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后有重要作用[19]。NGAL 在正常腎臟微弱表達(dá)，腎損傷后，NGAL mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上升，而且NGAL較易從血液和尿液標(biāo)本中被檢測(cè)出來，因此常作為腎臟損傷的檢測(cè)指標(biāo)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與草酸鈣結(jié)石模型組對(duì)比，雷帕霉素處理組中Kim-1及NGAL的水平均明顯上升，而氯喹處理組和NAC處理組均下降，表明在結(jié)石形成過程中自噬的激活進(jìn)一步加重了腎臟的損傷。

本課題組及其它學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑對(duì)預(yù)防腎結(jié)石的形成有顯著意義，如?；撬岷蚇AC，抗氧化劑可以通過減少ROS的形成，從而減少對(duì)腎臟損傷，降低結(jié)石形成[21-23]。而氯喹可通過抑制自噬體與溶酶體的結(jié)合，起到抑制自噬的作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NAC處理組相比，氯喹處理組大鼠的血清肌酐、尿素氮、Kim-1及NGAL的表達(dá)水平均下降，并且腎臟晶體沉積減少，表明氯喹可能在防治腎結(jié)石的形成中有一定的療效。

自噬是一把雙刃劍，適度的自噬可以對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用，而過度自噬則進(jìn)一步對(duì)機(jī)體造成損傷[9]。綜上所述，我們推斷在結(jié)石形成的過程中，高草酸尿和草酸鈣晶體不斷地刺激腎小管上皮細(xì)胞，引起細(xì)胞的損傷，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，釋放出ROS，介導(dǎo)自噬過度的激活，從而促進(jìn)炎癥因子的釋放，加重腎臟的損傷，最終誘導(dǎo)腎結(jié)石的形成。然而，其具體的調(diào)控機(jī)制仍需更深入研究。