萬(wàn)峰云，盧紅艷，萬(wàn)雪晴，朱 玥，郝曉波

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

肺泡II型上皮細(xì)胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell，AECII)是肺內(nèi)主要干細(xì)胞，能合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)，并增殖及分化為肺泡I型上皮細(xì)胞(type I alveolar epithelial cell，AECI)，在肺發(fā)育及肺損傷中發(fā)揮重要作用[1-3]。 CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα)是亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在細(xì)胞增殖、分化、信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤發(fā)生、機(jī)體免疫及應(yīng)激反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[4-5]。在肺臟中C/EBPα主要在呼吸道上皮細(xì)胞及AECⅡ中表達(dá)[6]。De Obaldia等[7]發(fā)現(xiàn)，C/EBPα啟動(dòng)子上游有Hes1結(jié)合位點(diǎn)，即N-box位點(diǎn)。Hes1是Notch信號(hào)中非常重要的靶基因，屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子。有研究表明,Notch信號(hào)可能通過(guò)介導(dǎo)bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，調(diào)控肺泡上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化及遷移等生物學(xué)活動(dòng)[8]。Notch1/Hes1信號(hào)是否調(diào)控C/EBPα表達(dá)從而影響AECII的增殖與分化，目前尚不清楚。本研究通過(guò)對(duì)Notch1/Hes1信號(hào)雙向調(diào)控，探討Notch1/Hes1信號(hào)是否調(diào)控C/EBPα表達(dá)從而影響AECII增殖及分化功能，為進(jìn)一步深入研究其與急、慢性肺損傷和修復(fù)的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

人AECII購(gòu)自賽百慷公司，細(xì)胞來(lái)源于人正常肺組織，采用AECII特異性表面活性蛋白C進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，純度高于90%。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自維森特生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；TRIzol購(gòu)自Invitrogen；PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa；抗Hes1抗體購(gòu)自Immunoway；抗Notch1及β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗C/EBPα及水通道蛋白5(aquaporin 5，AQP5)抗體購(gòu)自Santa Cruz；羊抗兔或抗鼠IgG和兔抗羊IgG購(gòu)自南京福麥斯公司；PE標(biāo)記的羊抗鼠Ig G購(gòu)自上海翊圣生物公司；CCK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biosharp；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD Biosciences；Notch通路激活劑重組人Jagged1購(gòu)自R&D Systems；Notch通路抑制劑DAPT購(gòu)自Target Mol。

2 方法

2.1AECII培養(yǎng)及分組 用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基將AECII置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，1 d換液1次，3 d傳代1次。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照(control)組、激活劑(Jagged1)組(加入Notch通路激活劑Jagged1蛋白500 μg/L)和抑制劑(DAPT)組(加入Notch通路抑制劑DAPT 10 μmol/L)，分別于干預(yù)后24 h收獲各組細(xì)胞。

2.2RT-qPCR法檢測(cè)Notch1、Hes1和C/EBPα的mRNA表達(dá)水平 用TRIzol 法提取各組AECII總mRNA，純度及濃度使用微量分光光度計(jì)檢測(cè)。cDNA 按試劑盒說(shuō)明書合成。PCR體系：12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM；PCR 上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；0.5 μL ROX Reference Dye Ⅱ(×50)；2.0 μL DNA模板；9.0 μL ddH2O；合計(jì)25 μL。PCR 條件：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。 PCR相關(guān)引物序列如下：Notch1的上游引物序列為5′-TAGATCCAACCCTTGTGTC-3′，下游引物序列為5′-GACGCACACTCGTTGATGTT-3′；Hes1的上游引物序列為5′-GAGTGCATGAACGAGGTGAC-3′，下游引物序列為5′-GGTCATGGCATTGATCTGG-3′；C/EBPα的上游引物序列為5′-GGTGGACAAGAACAGCAACG-3′，下游引物序列為5′-GGTCAGCTCCAGCACCTTCT-3′；β-actin的上游引物序列為5′-GCAGAAGGAGATTACTGCCCT-3′，下游引物序列為5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。以β-actin作為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt相對(duì)定量法分析。

2.3Western blot 法檢測(cè)Notch1、Hes1和C/EBPα 的蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞根據(jù)分組給予相應(yīng)處理后，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋的I抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入稀釋的II抗(1∶5 000)，室溫下孵育1 h。化學(xué)發(fā)光顯色，用凝膠分析成像系統(tǒng)掃描并分析，測(cè)定蛋白質(zhì)條帶吸光度(A)，以A目的蛋白/Aβ-actin比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2.4CCK-8 法檢測(cè)AECII的細(xì)胞活力 常規(guī)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AECII，配成 5×107/L 細(xì)胞懸液，接種于96孔板內(nèi)，按照實(shí)驗(yàn)分組予以細(xì)胞不同處理后，分別加入CCK-8 試劑每孔10 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔A值。

2.5活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將細(xì)胞接種于6孔板中，根據(jù)分組給予相應(yīng)處理24 h后，用胰酶消化離心重懸，將0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液按1∶1比例加入細(xì)胞懸液中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并算出活細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 各組細(xì)胞給予相應(yīng)處理后，用不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次后，加入預(yù)冷70%乙醇，于4 ℃固定過(guò)夜，固定結(jié)束后離心去除乙醇，用500 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液(50 mg/L PI+50 mg/L RNase)重懸細(xì)胞，37 ℃避光孵育30分鐘，用FACS CantoTMII流式細(xì)胞儀(BD)檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.7流式細(xì)胞標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞分化 AECII可分化為AECI，AQP5是AECI特異性表面標(biāo)志蛋白，其表達(dá)強(qiáng)弱直接反映AECI數(shù)量和(或)功能[9]。流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記法檢測(cè)AQP5，以標(biāo)記AQP5的陽(yáng)性細(xì)胞代表AECI。收集各組細(xì)胞，離心洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L。加入鼠抗人AQP5多克隆抗體(1∶100)，混勻，37 ℃孵育30 min，洗滌后，加入PE-抗鼠IgG(1∶100)，避光孵育15 min，上機(jī)檢測(cè)。利用FlowJo軟件作圖，將細(xì)胞分為2個(gè)亞群：AQP5+和AQP5-，結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞百分率表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩均數(shù)比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AECII中Notch1、Hes1及C/EBPα的mRNA表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，激活劑組Notch1、Hes1及C/EBPα的mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；抑制劑組Notch1、Hes1及C/EBPα的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of Notch1, Hes1 and C/EBPα in AECⅡ. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group．

圖1AECⅡ中Notch1、Hes1及C/EBPα的mRNA表達(dá)

2 AECII中Notch1、Hes1及C/EBPα的蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，激活劑組Notch1、Hes1及C/EBPα 的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)；抑制劑組Notch1、Hes1及C/EBPα 的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein expression of Notch1, Hes1 and C/EBPα in AECⅡ. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2AECⅡ中Notch1、Hes1及C/EBPα的蛋白表達(dá)

3 AECII的活力和增殖情況

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，激活劑組AECII的A450值較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；抑制劑組AECII值較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，見圖3?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，激活劑組活細(xì)胞數(shù)明顯增加而抑制劑組明顯減少(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.The absorbance (A) value of AECII. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3AECII吸光度值

4 AECII周期變化情況

流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果示，激活劑組G0/G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組低，而抑制劑組G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；激活劑組及抑制劑組S期細(xì)胞比例均較對(duì)照組低(P<0.05)；激活劑組G2/M期細(xì)胞比例高于對(duì)照組(P<0.05)，而抑制劑組與對(duì)照組無(wú)明顯差異，見圖5。

Figure 4.The relative numbers of AECII. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4AECII活細(xì)胞計(jì)數(shù)

5 AECII分化情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AQP5，以標(biāo)記AQP5的陽(yáng)性細(xì)胞代表AECI。結(jié)果顯示激活劑組的AQP5陽(yáng)性細(xì)胞百分比較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；抑制劑組的AQP5陽(yáng)性細(xì)胞百分比較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，見圖6。

討 論

Notch信號(hào)在多種組織和器官早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，Hes1是Notch信號(hào)中非常重要的靶基因[10]。Jagged1蛋白增加了Notch1信號(hào)通路中主要配體數(shù)量，直接激活Notch1通路；DAPT(γ-分泌酶抑制劑)能夠抑制通路關(guān)鍵酶γ-分泌酶的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制整個(gè)Notch1信號(hào)系統(tǒng)活性[11]，故目前很多研究采用Jagged1和DAPT分別作為Notch信號(hào)通路的激活劑及抑制劑。本研究表明，激活Notch1/Hes1信號(hào)可有效上調(diào)Notch1與Hes1 mRNA及蛋白水平，而抑制Notch1/Hes1信號(hào)可有效下調(diào)Notch1與Hes1 mRNA及蛋白水平，可見利用特異性激活劑和抑制劑對(duì)Notch1/Hes1信號(hào)雙向調(diào)控成功。AECII是肺內(nèi)主要干細(xì)胞，可增殖分化為AECI。C/EBPα作為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在妊娠后期呼吸道上皮細(xì)胞增殖與分化過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要作用[12]。C/EBPα缺失胎鼠在出生后存在肺結(jié)構(gòu)分化及成熟障礙，極易出現(xiàn)呼吸衰竭而死亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，在T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，C/EBPα轉(zhuǎn)錄受Notch信號(hào)靶基因Hes1調(diào)控，這對(duì)于T細(xì)胞分化非常重要。在AECII中，C/EBPα轉(zhuǎn)錄是否也受Notch1/Hes1信號(hào)通路調(diào)控，目前尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，激活Notch1/Hes1信號(hào)可使C/EBPα mRNA及蛋白水平增加，而抑制Notch1/Hes1信號(hào)可使C/EBPα mRNA及蛋白水平降低，表明Notch1/Hes1信號(hào)通路可調(diào)控AECⅡ表達(dá)C/EBPα。

Figure 5.The changes of cell cycle distribution. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖5AECII細(xì)胞周期的變化

Figure 6.AQP5 positive cell proportion. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group．

圖6AQP5陽(yáng)性細(xì)胞比

Cook等[14]發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)活性增強(qiáng)可引起C/EBPα水平增加，骨髓祖細(xì)胞數(shù)量增加，而抑制Notch信號(hào)后C/EBPα表達(dá)水平和骨髓祖細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)到對(duì)照水平，說(shuō)明Notch信號(hào)可調(diào)控C/EBPα表達(dá)，從而影響骨髓祖細(xì)胞增殖。在脂肪組織中，激活Notch信號(hào)通路后，C/EBPα表達(dá)上調(diào)，從而調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞分化[15]。本研究通過(guò)CCK-8法、流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期、活細(xì)胞計(jì)數(shù)及流式細(xì)胞標(biāo)記AQP5了解AECⅡ增殖及分化情況，進(jìn)一步明確Notch1/Hes1信號(hào)通路調(diào)控C/EBPα表達(dá)是否影響AECⅡ增殖及分化功能。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，激活Notch1/Hes1信號(hào)通路，CCK-8吸光度值增加，促進(jìn)AECII細(xì)胞從S期進(jìn)入G2/M期，活細(xì)胞數(shù)增加，標(biāo)記AQP5陽(yáng)性細(xì)胞比減少，說(shuō)明激活Notch1/Hes1信號(hào)通路可促進(jìn)AECⅡ細(xì)胞周期進(jìn)程且增殖增強(qiáng)而分化減弱；而抑制Notch1/Hes1信號(hào)通路，CCK-8吸光度值較對(duì)照組減少，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期細(xì)胞比例明顯降低，活細(xì)胞數(shù)減少，標(biāo)記AQP5陽(yáng)性細(xì)胞比增加，說(shuō)明AECII阻滯于G0/G1期從而增殖受抑，而AECII向AECI分化增強(qiáng)，提示Notch1/Hes1信號(hào)可調(diào)控C/EBPα表達(dá)從而影響AECII增殖及分化功能。

經(jīng)過(guò)電離輻射的多能造血干細(xì)胞造血功能低下，激活Notch信號(hào)通路后，C/EBPα表達(dá)恢復(fù)正常，多能造血祖細(xì)胞恢復(fù)自我更新[16]。前期研究發(fā)現(xiàn)[17-18]，高氧損傷的AECII中Notch1表達(dá)降低，Notch信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)受抑，AECII轉(zhuǎn)分化異常，而C/EBPα表達(dá)也降低，AECII增殖能力受抑。激活Notch信號(hào)通路后能否恢復(fù)C/EBPα表達(dá)，從而恢復(fù)AECII增殖與分化功能，有待進(jìn)一步研究。