王 蕾, 張 毅，嚴(yán)紅燕, 王旭東

(南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1急診中心， 2神經(jīng)外科， 3中醫(yī)科， 江蘇 南通 226001)

展神經(jīng)由于缺乏神經(jīng)外膜、基底膜和牢固的神經(jīng)束膜包被，且缺少連接神經(jīng)束的結(jié)締組織，修復(fù)存在困難[1]，而小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫吞噬細(xì)胞，在不同的微環(huán)境中可以表現(xiàn)為不同的細(xì)胞亞型：經(jīng)典激活M1型與選擇激活M2型。M1型主要誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，但過多的炎癥反應(yīng)因子也會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞的損傷及凋亡[2]; M2型小膠質(zhì)細(xì)胞主要抑制機(jī)體過度的免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥修復(fù)，保證神經(jīng)修復(fù)與再生[3]。作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)重要的一種非藥物治療方法，針刺的基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，電針刺激受損神經(jīng)可有效地提高該神經(jīng)功能恢復(fù)率[4]。本研究觀察電針對(duì)Beagle犬展神經(jīng)損傷模型中小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響，初步探討小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)對(duì)于展神經(jīng)損傷治療的臨床意義。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用普通級(jí)健康Beagle犬(6月齡,n=20)，雌雄各半，體重(15±0.5) kg，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào):SCXK(蘇)2008-0010。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于單獨(dú)的犬房，可自由走動(dòng)，12 h給予光照-黑暗的周期循環(huán)模式，保證適宜的溫度進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)2周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療4周取材，動(dòng)物的處理遵守國家健康協(xié)會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1展神經(jīng)損傷模型的建立及分組 術(shù)前12 h禁食后注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)靜脈麻醉。將Beagle犬置于手術(shù)臺(tái)采取側(cè)臥位，固定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頭顱，耳緣牽向尾側(cè)固定，麻醉充分開顱后皮瓣翻向外側(cè)，經(jīng)顳肌附著處縱向切開。經(jīng)顳底入路開顱，骨窗盡量靠近顱底，擴(kuò)大骨窗范圍從眶后到顴弓前，并沿顳骨窗下緣切開硬腦膜沿斜坡向上外方做一創(chuàng)口約3.5 cm×3.5 cm。向內(nèi)、上方牽拉顳葉牽開腦組織，磨除巖骨前部分暴露深部的展神經(jīng)。用有齒止血鉗擠壓夾閉展神經(jīng)30 s后直視鉗壓處組織菲薄，切斷展神經(jīng)軸突但維持神經(jīng)鞘膜完整性，以犬眼球呈內(nèi)斜視表明造模成功，連續(xù)2周，每次持續(xù)15 min。實(shí)驗(yàn)分為：正常對(duì)照(control, C)組：不進(jìn)行任何神經(jīng)損傷處理，正常喂養(yǎng)對(duì)照;假手術(shù)(sham operation, S)組：僅暴露分離展神經(jīng)，術(shù)中不進(jìn)行神經(jīng)損傷處理，縫合切口皮膚，在電針刺激時(shí)進(jìn)行束縛；損傷(injury, I)組：制作展神經(jīng)損傷模型，將電極插入外直肌但不進(jìn)行脈沖刺激；電針處理(electroacupuncture, E)組：Beagle犬展神經(jīng)損傷模型建立后進(jìn)行電針刺激，插入位置與I組相同，I組同時(shí)在E組進(jìn)行電針刺激時(shí)進(jìn)行束縛。

2.2電針刺激 E組展神經(jīng)損傷模型制作完成后將2個(gè)電極(5 F導(dǎo)管)分別置入神經(jīng)損傷處2側(cè)。向外方牽拉上下眼瞼，在瞼板與球結(jié)膜交界處充分暴露外直肌，將電極均插入外直肌，植入深度約3.0 mm，間距約4.0 mm，縫合切口固定電極。游離端自眼眶后下方引出固定，形成回路，術(shù)后連續(xù)2周給予電針刺激，，每次持續(xù)15 min。參數(shù)設(shè)置：脈沖頻率為5 Hz，時(shí)程0.1 ms，強(qiáng)度1.0 V。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 Beagle犬麻醉后，無菌操作下迅速取下犬眼內(nèi)的視神經(jīng)(展神經(jīng))，放在Hanks液中洗去血液，在體視顯微鏡下剝離神經(jīng)鞘膜；用已滅菌的剪刀機(jī)械將組織剪碎，加入0.25%的胰酶后放37 ℃烘箱消化3次，每次3 min，完全培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)液∶小牛血清∶胎牛血清=8∶1∶1)終止消化；每次將消化液經(jīng)100目篩濾下，收集3次消化濾液14 000×g離心5 min，棄去上清，完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入12孔板中；37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min后，轉(zhuǎn)移上清至新的12孔板中繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)2周時(shí)間，待細(xì)胞平鋪開，200 r/min搖床振蕩4 h，取上清至新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

2.4Western blot檢測小膠質(zhì)細(xì)胞的M1和M2標(biāo)志性分子表達(dá) 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周取材進(jìn)行Western blot檢測展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)水平。取上述各組Beagle犬每組5只，用10%水合氯醛進(jìn)行深度麻醉后，迅速用手術(shù)剪剪下展神經(jīng)節(jié)段，在低溫?zé)o菌冰盤上進(jìn)行操作，分離出少許神經(jīng)組織置于1 mL勻漿器球狀部位，盡量充分剪碎組織。加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)的400 μL單去污劑裂解液進(jìn)行勻漿。裂解30 min后在4 ℃、 12 000×g離心10 min，取上清分裝置于-20 ℃保存。提取小膠質(zhì)細(xì)胞的總蛋白，通過NanoDrop定量，取40 ug蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白以恒定電流30 mA，電轉(zhuǎn)90 min轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜上，TBST洗膜3次，然后含5%TBST的脫脂奶粉以60 r/min的速度封閉60 min，加入I抗[稀釋度：白細(xì)胞介素1β (interleukin 1β, IL-1β)為1∶200，誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)為1∶3 000，精氨酸酶(arginase)為1∶1 000，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)為1∶200]4 ℃冰箱孵育過夜，I抗孵育完成后TBST漂洗3次，再移至新雜交袋中，與熒光標(biāo)記II抗(1∶20 000)常溫孵育60 min， TBST充分清洗后以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)法顯影并拍照，進(jìn)行條帶灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 19.0對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。小膠質(zhì)細(xì)胞M1和M2型標(biāo)志分子表達(dá)水平用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 電針治療后展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞M1表型標(biāo)志物的比較

4組均檢測到M1特異性標(biāo)志分子(iNOS和IL-1β)。I組iNOS的表達(dá)較C組比較增加(P<0.05)；而E組iNOS表達(dá)較I組明顯降低(P<0.05)，同時(shí)與C組及S組比較均無顯著差異。I組和E組IL-1β的表達(dá)與C組比較均增加(P<0.05)；與I組相比，E組IL-1β降低(P<0.05),見圖1、表1。

Figure 1.The expression of M1 and M2 phenotype markers of abducens nerve microglia was detected by Western blot.

圖1展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞M1和M2表型標(biāo)志物的表達(dá)

表1各組展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞M1表型標(biāo)志物的比較

Table 1.Comparison of M1 phenotype markers of abducens nerve microglia in each group (Mean±SD.n=5)

GroupiNOSIL-1βC0.09±0.290.01±1.05S0.11±0.930.02±1.29I 0.31±0.89?0.09±1.15?E 0.14±1.01△ 0.05±0.91?△

*P<0.05vsC group；△P<0.05vsI group.

2 電針治療后展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞M2表型標(biāo)志物的比較

M2特異性標(biāo)志蛋白(arginase和BDNF)在4組均被檢測出。與C組相比，I組和E組arginase表達(dá)均增加(P<0.05)；而E組的arginase表達(dá)較I組增加(P<0.05)。BDNF在I和E組的表達(dá)均增加(P<0.05)；而E組的BDNF較I組表達(dá)增加(P<0.05),見圖1、表2。

表2各組展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞M2表型標(biāo)志物的比較

Table 2.Comparison of M2 phenotype markers of abducens nerve microglia in each group (Mean±SD.n=5)

GroupArginaseBDNFC0.21±1.220.04±0.07S0.25±1.140.05±1.08I 0.38±1.03? 0.49±0.78?E0.67±0.89?△0.82±0.68?△

*P<0.05vsC group；△P<0.05vsI group.

討 論

電針治療通過調(diào)節(jié)炎癥因子釋放、改善代謝微環(huán)境，減輕損傷細(xì)胞炎癥反應(yīng)和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]。目前研究主要集中在面神經(jīng)和坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)，在動(dòng)眼神經(jīng)損傷修復(fù)亦有相關(guān)研究。同時(shí)利用電針刺激展神經(jīng)麻痹亦取得了較好的療效，但關(guān)于針刺相關(guān)研究集中在腦血管病，而在展神經(jīng)修復(fù)機(jī)制研究較少[7-8]。我們前期研究顯示電針刺激可以明顯促進(jìn)損傷的展神經(jīng)恢復(fù)[9]，但機(jī)制尚不明確。

大腦主要的免疫細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞約占大腦膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的20%左右[10]，其中經(jīng)典激活M1型表面抗原包括CD80、CD86和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ, MHCⅡ)等，在應(yīng)激狀態(tài)下通過IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)等促炎因子分泌，主要誘導(dǎo)iNOS合成，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[11]。而對(duì)于神經(jīng)保護(hù)作用主要依靠選擇激活M2型，主要參與神經(jīng)細(xì)胞再生及凋亡組織細(xì)胞的吞噬清理[12]，表面抗原主要為Ym-1、CD206和arginase等，通過分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、IL-4、IL-3 和胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)等抗炎因子及BDNF、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)等營養(yǎng)因子抑制神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)[13-14]。有研究表明缺血性腦卒中后分泌BDNF通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)及磷酯酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)2條信號(hào)通路發(fā)揮小膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)作用[15]。所以我們大膽猜測BDNF在展神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)中亦發(fā)揮保護(hù)作用，本研究與之相符。另外arginase能預(yù)防細(xì)胞外基質(zhì)降解，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞遷移，促進(jìn)功能性突觸形成而降低神經(jīng)元損害[16]，是M2重要的標(biāo)志蛋白之一。

本研究中我們觀察電針對(duì)Beagle犬展神經(jīng)損傷模型中小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響，探索電針治療受損展神經(jīng)的修復(fù)機(jī)制。Western blot檢測展神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)水平的結(jié)果中，C組與S組比較無顯著差異，即可排除手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示電針治療后M1型標(biāo)志蛋白水平趨于對(duì)照組，而M2特異性標(biāo)志蛋白較對(duì)照組明顯增加。上述結(jié)果表明電針治療能改善受損展神經(jīng)的修復(fù)情況，機(jī)制可能與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞M1和M2型標(biāo)志蛋白表達(dá)相關(guān)。我們選擇的時(shí)點(diǎn)不能顯示出全部小膠質(zhì)細(xì)胞M1和M2表型標(biāo)志物的變化規(guī)律，今后的實(shí)驗(yàn)還需擴(kuò)大檢測范圍和動(dòng)態(tài)監(jiān)測。