崔美英，賀紅柳，李 盼，毛 穎

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科， 河南 鄭州 450052)

肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率一直都位居全球首位。全世界每年肺癌的發(fā)病人數(shù)與死亡人數(shù)約為186萬例和160萬例[1]。在中國，男性肺癌的發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第1位，女性發(fā)病率占第2位，死亡率占第1位[2]。順鉑(cisplatin，cis-dichlorodiammine platinum，DDP) 是目前廣泛采用且效果較好的治療肺癌的化療藥物，但耐藥性的產(chǎn)生是限制其療效的主要原因[3]，因此逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性對延長肺癌患者的生存期十分有益。柚皮苷(naringin，NRG)是一種雙氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，也是骨碎補、枳實、枳殼和化橘紅等中藥的主要有效成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗動脈粥樣硬化和調(diào)節(jié)血糖等藥理作用[4-8]。近年來的研究顯示，柚皮苷可通過誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖、阻礙侵襲和轉(zhuǎn)移以及提高化療藥物敏感性而發(fā)揮抗腫瘤活性[9-11]。但關(guān)于柚皮苷對人肺癌耐順鉑細胞株A549/DDP是否具有逆轉(zhuǎn)作用尚未見報道。本實驗旨在體外觀察柚皮苷對人肺癌耐藥株A549/DDP細胞的逆轉(zhuǎn)作用，并探討其可能的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺癌細胞A549和順鉑耐藥株A549/DDP購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。柚皮苷購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone；順鉑購自Sigma；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、p-Akt、CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自Abcam。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 人肺癌A549細胞和順鉑耐藥株A549/DDP細胞用含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。每2～3 d常規(guī)傳代1次。為保持A549/DDP細胞的順鉑耐藥性，每次換液時在細胞培養(yǎng)液中均添加順鉑(終濃度為1 mg/L)。

2.2CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期A549/DDP細胞，以每孔5 000個接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中孵育過夜,實驗分成4組：(1)順鉑+A549細胞組：順鉑終濃度分別為2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L和10 μmol/L；(2)順鉑+A549/DDP細胞組：順鉑終濃度分別為4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L和64 μmol/L；(3)柚皮苷+A549/DDP細胞組：柚皮苷終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L和160 μmol/L；(4)順鉑+柚皮苷+A549/DDP細胞組：順鉑和柚皮苷的梯度濃度分別與(2)、(3)組相同，二者聯(lián)用的濃度比為1∶2.5；每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)無細胞調(diào)零組和無藥對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h，用酶標儀檢測各孔450 nm波長吸光度A值，實驗重復(fù)3次。按照下列公式計算藥物對細胞活力的抑制率：抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。使用SPSS 16.0軟件的Probit回歸模型計算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，并計算出耐藥倍數(shù)，耐藥倍數(shù)=DDP對耐藥細胞的IC50/DDP對敏感細胞的IC50。

2.3藥物聯(lián)合效應(yīng)的評價 采用Chou-Talalay中效分析法對藥物聯(lián)合效應(yīng)進行評估。中效方程式為:fa/fu =(D/Dm)m，其中fa為抑制率，fu=1-fa，D為藥物濃度，Dm為中效濃度，m為中效曲線斜率。兩邊取對數(shù)得lg(fa/fu)=mlgD-mlgDm，設(shè)Y=lg(fa/fu)，X=lgD, b=m，a=-mlgDm，得線性方程式：Y=a+bX。兩藥合用在不同效應(yīng)的聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)的計算公式為：CI=D1/DX1+D2/DX2，其中DX1和DX2為兩藥單用產(chǎn)生X效應(yīng)時各自所需濃度，D1和D2為兩藥聯(lián)用產(chǎn)生X效應(yīng)時各自所需濃度，均可由中效方程式求得。應(yīng)用CompuSyn 1.0軟件繪制Fa-CI曲線，若CI<1，認為兩藥為協(xié)同作用，CI=1為相加作用，CI>1為拮抗作用。

2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期A549/DDP細胞，分為無藥對照(control)組、順鉑(DDP)組、柚皮苷(NRG)組及順鉑與柚皮苷聯(lián)用(NRG+DDP)組，其中順鉑和柚皮苷的終濃度分別為16 μmol/L和40 μmol/L。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集各組細胞，PBS洗滌2次，先加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，送流式細胞儀分析檢測。

2.5Western blot法檢測蛋白水平 裂解細胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度，取25 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用脫脂奶粉封閉1 h，加入I 抗(抗P-gp、MRP1、p-Akt、CXCR4、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3抗體均以1∶1 000稀釋，抗β-actin抗體以1∶2 000稀釋)，于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入 II 抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照，使用ImageJ 1.45 s軟件進行灰度分析。以目標蛋白與內(nèi)參照β-actin灰度值的灰度比值作為目標蛋白的相對表達水平。實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，Shapiro-Wilk法檢驗正態(tài)分布，Levene法檢驗方差齊性。細胞抑制率、流式細胞術(shù)和Western blot檢測數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊性，故采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni法進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 順鉑耐藥前后A549細胞中相關(guān)蛋白表達的變化

我們采用Western blot法檢測了順鉑耐藥相關(guān)蛋白的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與非順鉑耐藥株A549細胞相比，順鉑耐藥株A549/DDP細胞中的P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，表明A549細胞順鉑耐藥性的產(chǎn)生可能與上述蛋白的高表達密切相關(guān)，見圖1。

Figure 1.The protein expression of P-gp, MRP1, p-Akt and CXCR4 in A549 and A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA549 cells.

圖1A549和A549/DDP細胞中P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白的表達

2 柚皮苷和順鉑對A549/DDP細胞活力的影響

與0 μmol/L組相比，2～10 μmol/L DDP組的A549細胞活力均明顯降低(P<0.05)，IC50為6.37 μmol/L，見圖2。A549/DDP細胞經(jīng)順鉑和柚皮苷單獨處理24 h后，細胞活力受到顯著抑制，且呈劑量依賴性(P<0.05)，IC50分別為36.92 μmol/L和129.77 μmol/L；與DDP單獨用藥組相比，當(dāng)2種藥物按1∶2.5聯(lián)合作用時，對細胞活力的抑制作用顯著強于相同濃度的順鉑處理組(P<0.05)，見圖3。藥物聯(lián)合作用24 h的IC50為57.72 μmol/L，其中順鉑和柚皮苷的濃度分別為16.49 μmol/L和41.23 μmol/L。這表明柚皮苷與順鉑單獨或聯(lián)合作用對人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP均具有毒性作用，且二者聯(lián)用效應(yīng)更強。

3 柚皮苷和順鉑聯(lián)合應(yīng)用評價

依據(jù)上述CCK-8法結(jié)果，采用CompuSyn 1.0軟件計算得出Fa-CI曲線，當(dāng)Fa<0.15時，CI>1，柚皮苷和順鉑聯(lián)用呈拮抗效應(yīng)；當(dāng)Fa>0.15時，CI<1，兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，見圖4。

Figure 2.The effect of DDP on the viability of the A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖2DDP對A549細胞活力的影響

4 柚皮苷和順鉑對A549/DDP細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，順鉑組、柚皮苷組以及柚皮苷與順鉑聯(lián)用組的細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)，其中順鉑和柚皮苷的終濃度分別為16 μmol/L和40 μmol/L；此外，柚皮苷與順鉑聯(lián)用組的細胞凋亡率顯著高于順鉑組(P<0.05),提示柚皮苷可協(xié)同增強順鉑誘導(dǎo)的A549/DDP細胞凋亡，見圖5。

Figure 3.The inhibitory effect of NRG and/or DDP on the viability of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsDDP group.

圖3柚皮苷與順鉑單獨或聯(lián)合抑制A549/DDP細胞活力

Figure 4.The graph of combination index (CI) and fraction affected (Fa).

圖4藥物聯(lián)合指數(shù)(CI)與抑制率(Fa)曲線圖

Figure 5.The effects of NRG and DDP on the apoptosis of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDDP group.

圖5柚皮苷和順鉑對A549/DDP細胞凋亡的影響

5 柚皮苷與順鉑對Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，順鉑組、柚皮苷組以及柚皮苷與順鉑聯(lián)用組的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平下調(diào)(P<0.05)；與順鉑組相比，柚皮苷與順鉑聯(lián)用組的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05),提示柚皮苷協(xié)同增強順鉑誘導(dǎo)A549/DDP細胞凋亡可能與Bcl-2/Bax比率下調(diào)有關(guān)，見圖6。

Figure 6.The effects of NRG and DDP on the protein levels of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 in the A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDDP group.

圖6柚皮苷和順鉑對Bcl-2、Bax和cleavedcaspase-3蛋白水平的影響

6 柚皮苷對P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平的影響

Western blot法的檢測結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度柚皮苷處理24 h后，A549/DDP細胞中的P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平明顯下調(diào)，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖7。

討 論

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,由于大多數(shù)患者確診時已發(fā)展至晚期，失去了手術(shù)治療機會，因此化療成為治療肺癌的主要手段。順鉑是臨床治療肺癌常用的一線化療藥物，多數(shù)患者在化療初期對順鉑敏感，但隨后產(chǎn)生的耐藥性限制了順鉑的臨床應(yīng)用。順鉑耐藥性的產(chǎn)生涉及多種機制，其中膜轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的藥物外排是導(dǎo)致順鉑耐藥的重要機制之一，如P-gp和MRP1等過度表達可降低藥物對肺癌細胞的毒性作用[12]。此外，肺癌細胞還可通過提高抗凋亡能力降低對順鉑的敏感性[13]。在本研究中，順鉑對A549細胞和A549/DDP細胞的IC50分別為6.37 μmol/L和36.92 μmol/L，耐藥株A549/DDP細胞的耐藥倍數(shù)為5.80;Western blot法檢測也證實順鉑耐藥相關(guān)蛋白P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4在順鉑耐藥株A549/DDP細胞中呈高表達。

Figure 7.The effects of NRG on the protein levels of P-gp, MRP1, p-Akt and CXCR4 in the A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vs20 μmol/L group;△P<0.05vs40 μmol/L group.

圖7柚皮苷對P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平的影響

近年來，多項人體研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷是一種安全高效的P-gp抑制劑，并對藥物代謝動力產(chǎn)生影響[14-16]，提示柚皮苷在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥方面潛力較大。Zhu等[11]研究證實，柚皮苷可通過下調(diào)P-gp蛋白逆轉(zhuǎn)人卵巢癌SKOV3/DDP細胞的順鉑耐藥性。但目前對于柚皮苷對人肺癌耐順鉑細胞株A549/DDP的逆轉(zhuǎn)作用尚未見報道。在本研中，我們采用CCK-8法檢測了柚皮苷與順鉑對人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP細胞的毒性作用，結(jié)果表明，柚皮苷與順鉑均可顯著抑制A549/DDP細胞活力且具有劑量依賴性，兩藥聯(lián)用則對細胞活力的抑制作用更加顯著。進一步采用Chou-Talalay中效分析法對兩藥的聯(lián)合效應(yīng)進行評價后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制率超過15%時，兩藥聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。與之相一致，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果也表明，柚皮苷可增強順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡。上述結(jié)果表明，柚皮苷可逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性。

為初步探究柚皮苷與順鉑協(xié)同誘導(dǎo)A549/DDP細胞凋亡的分子機制，我們采用Western blot法檢測了Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及p-Akt蛋白水平的變化。Bcl-2是Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白，而Bax為促凋亡蛋白。當(dāng)Bcl-2表達上調(diào)和/或Bax表達下調(diào)時，順鉑的促凋亡作用可被顯著抑制[17-18]。Zhang等[19]研究證實，使用PI3K/Akt通路抑制劑wortmannin可誘導(dǎo)A549/DDP細胞凋亡，并逆轉(zhuǎn)其順鉑耐藥性。本研究結(jié)果顯示，柚皮苷和順鉑單獨作用均可顯著下調(diào)Bcl-2蛋白水平、上調(diào)Bax和cleaved caspase-3蛋白水平，兩藥聯(lián)用可協(xié)同增強對Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平的調(diào)控。同時柚皮苷還可劑量依賴性地下調(diào)p-Akt蛋白水平。這初步揭示了柚皮苷增強順鉑誘導(dǎo)A549/DDP細胞凋亡的分子機制。

CXCR4是G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體。研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在多種惡性腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[20-23]。近年來多項研究證實，CXCR4與多種腫瘤的順鉑耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[24-25]。Xie等[26]研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4在順鉑耐藥患者的肺癌組織中的表達明顯高于其在順鉑敏感患者的肺癌組織中的表達，同時還發(fā)現(xiàn)在體外沉默CXCR4基因表達可逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞的順鉑耐藥性。在本研究中，柚皮苷可劑量依賴性地下調(diào)CXCR4蛋白水平。由此推測，這可能是柚皮苷逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞順鉑耐藥性的機制之一。

P-gp和MRP1同為ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporters, ABC transporters)超家族成員，這類蛋白質(zhì)能夠結(jié)合ATP 并利用能量將細胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運至胞外。Zheng等[27]采用改良的納米顆粒將P-gp的siRNA導(dǎo)入A549/DDP細胞后，可顯著提高A549/DDP細胞對順鉑的敏感性。采用RNA干擾技術(shù)沉默MRP1基因表達也同樣可以增強順鉑對A549/DDP細胞的毒性作用[28]。本研究證實，柚皮苷可劑量依賴性地下調(diào)P-gp和MRP1的蛋白水平,這將有助于減少順鉑的外排，從而提高A549/DDP細胞對順鉑的敏感性。

綜上所述，柚皮苷可協(xié)同增強人肺癌耐藥株A549/DDP細胞對順鉑的敏感性，這可能與柚皮苷上調(diào)Bax蛋白水平，下調(diào)P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平，進而促進凋亡和減少順鉑外排有關(guān)。本研究為柚皮苷改善肺癌治療現(xiàn)狀提供了一定的證據(jù)支持。