遲毓婧，李 玫，禹祎萌，劉愛禹，郁衛(wèi)東，莫 珩

(北京大學(xué)人民醫(yī)院 1中心實(shí)驗(yàn)室和臨床分子生物學(xué)研究所， 2口腔科， 北京 100044)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous-cell carcinoma, OSCC)是常見的腫瘤，占口腔惡性病變的95%，近二十年其發(fā)病率不斷上升[1]，尤其是在年輕患者中，全球每年新增病例超過(guò)30萬(wàn)，盡管近年來(lái)對(duì)于OSCC的診斷和治療有實(shí)質(zhì)性進(jìn)步，但其5年生存率仍然僅為50%[2]。因此亟待找出新的治療靶點(diǎn)對(duì)OSCC進(jìn)行特異性的干預(yù)，以其提高OSCC患者的生存率。

FAM3(family with sequence similarity 3)家族是2002年克隆的一個(gè)細(xì)胞因子樣基因家族，包括4個(gè)成員：FAM3A (FAM3, member A)、FAM3B (FAM3, member B)、FAM3C (FAM3, member C)和FAM3D (FAM3, member D)。FAM3C也被稱作白細(xì)胞介素樣上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)因子(interleukin-like epithelial-mesenchymal transition inducer, ILEI)，在人和小鼠全身多種組織中高度表達(dá)[3]。目前的研究報(bào)道，F(xiàn)AM3C作為一種新型的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及轉(zhuǎn)移的調(diào)控分子，在結(jié)腸癌[4]、胰腺癌[5]和食管鱗狀細(xì)胞癌[6]等的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

最新的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM3C在患者OSCC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[7]，但目前對(duì)于FAM3C參與OSCC發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚未有研究報(bào)道。蛋白激酶B (protein kinase B,Akt)已被認(rèn)為是一種重要的原癌基因，在多種腫瘤，尤其是低分化腫瘤中存在Akt的激活，并具有更高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和更差的預(yù)后[8]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)在小鼠肝臟及肝細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FAM3C能顯著激活A(yù)kt[9-10]。FAM3C是否也能通過(guò)激活A(yù)kt參與OSCC的增殖仍然未知。本文分別在口腔鱗癌癌前病變細(xì)胞DOK和口腔鱗癌細(xì)胞WSU-HN6中，初步探究FAM3C的表達(dá)變化及其影響OSCC細(xì)胞活力的機(jī)制，以期為OSCC的臨床診療提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 主要儀器和試劑

實(shí)時(shí)定量PCR儀和酶標(biāo)儀(Bio-Red)；凝膠成像儀(GE)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)。胎牛血清(Corning)；高糖DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素(Gibco)；細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8; Dojindo)；高效真核轉(zhuǎn)染試劑Vigofect(北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司)；TRIzol和cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)試劑盒(TOYOBO)；PCR引物購(gòu)自上海生工生物股份有限公司；蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和PMSF(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白marker和化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo)；硝酸纖維素膜(Pall)；抗FAM3C抗體(Abcam)；抗p-Akt和Akt抗體(Cell Signaling Technology)；抗β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(中杉金橋)。DOK口腔癌前病變細(xì)胞系和WSU-HN6口腔鱗癌細(xì)胞系由北京大學(xué)口腔醫(yī)院提供。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 口腔鱗癌癌前病變細(xì)胞系DOK和口腔鱗癌細(xì)胞系WSU-HN6使用添加青霉素、鏈霉素及10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞傳代使用0.25%的胰蛋白酶消化。WSU-HN6細(xì)胞使用抗FAM3C抗體(2.5 mg/L)處理(WSU-HN6+anti-FAM3C)，對(duì)照(WSU-HN6+solvent)組使用抗體溶劑處理，24、48和72 h后進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，并提取細(xì)胞的總RNA及總蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。DOK細(xì)胞分別使用感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=50的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)腺病毒(adenovirus-GFP，Ad-GFP)和FAM3C腺病毒(adenovirus-FAM3C, Ad-FAM3C)腺病毒處理細(xì)胞，24、48和72 h后進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，并提取細(xì)胞的總RNA及總蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染 WSU-HN6細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染對(duì)照(WSU-HN6+scramble)和FAM3CsiRNA(WSU-HN6+siFAM3C)，轉(zhuǎn)染前1 h更換新鮮培養(yǎng)液，首先將4條siRNA的混合物(50 nmol/L)與生理鹽水混合5 min，同時(shí)將轉(zhuǎn)染試劑(Vigofect)與生理鹽水混合5 min，之后將2種混合15 min后逐滴加入到6孔板或96孔板中，轉(zhuǎn)染4 h后更換為新鮮培養(yǎng)液，在轉(zhuǎn)染后24、48和72 h后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，并提取細(xì)胞的總RNA及總蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siRNA序列見表1。

表1 siFAM3C序列

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 DOK和WSU-HN6細(xì)胞各取3×103個(gè)細(xì)胞種植在96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，分別在不同處理的0、24、48及72 h更換培養(yǎng)液并加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm處進(jìn)行吸光度(A)值的測(cè)定，每種處理重復(fù)4次，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以A值為縱坐標(biāo)，處理時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

2.4RT-qPCR 每孔細(xì)胞使用1 mL RNA裂解液(TRIzol)提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定總RNA濃度后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄2μg的cDNA。使用含有SYBR Green 1熒光染料的PCR混合物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR，以β-actin作為內(nèi)參照，引物序列見表2。依據(jù)公式2-ΔΔCt法計(jì)算FAM3C mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表2 RT-qPCR引物序列

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 每孔細(xì)胞加入60 μL蛋白裂解液，15 520×g離心15 min后取上清，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白的濃度。使用40 μg的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%奶粉室溫封閉1 h后加入抗FAM3C、p-Akt(Ser473)、Akt及β-actin抗體，4 ℃過(guò)夜。第2天孵育Ⅱ抗，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，ImageJ軟件分析結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 口腔鱗癌細(xì)胞中FAM3C的表達(dá)上調(diào)

與癌前病變DOK細(xì)胞相比，WSU-HN6細(xì)胞中FAM3C mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖1A。在WSU-HN6細(xì)胞中FAM3C的蛋白表達(dá)水平也較DOK細(xì)胞顯著升高(P<0.01)，同時(shí)FAM3C的下游分子p-Akt蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.01)，總Akt蛋白的表達(dá)水平無(wú)顯著差異，見圖1B。

Figure 1.The mRNA and protein expression of FAM3C and the phosphorylation of Akt in DOK and WSU-HN6 cells. A: the mRNA expression of FAM3C in DOK and WSU-HN6 cells; B: the protein expression of FAM3C and p-Akt in DOK and WSU-HN6 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDOK group.

圖1DOK與WSU-HN6細(xì)胞中FAM3CmRNA及蛋白表達(dá)水平和Akt磷酸化水平

2 siRNA敲減FAM3C抑制WSU-HN6細(xì)胞的活力

WSU-HN6細(xì)胞在siFAM3C處理24、48和72 h，F(xiàn)AM3C的mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖2A。與對(duì)照(WSU-HN6+scramble)組相比，siFAM3C處理(WSU-HN6+siFAM3C)組WSU-HN6細(xì)胞的活力在48 h和72 h顯著受到抑制(P<0.05),見圖2B。siFAM3C處理后24、48和72 h，F(xiàn)AM3C蛋白表達(dá)水平下降，p-Akt蛋白的表達(dá)顯著受到抑制(P<0.01)，但總Akt的蛋白表達(dá)沒(méi)有變化，見圖2C。

3 抗體封閉FAM3C蛋白抑制WSU-HN6細(xì)胞的活力

與溶劑處理的對(duì)照(WSU-HN6+solvent)組相比，F(xiàn)AM3C抗體(WSU-HN6+anti-FAM3C組)在48 h和72 h可以顯著抑制WSU-HN6細(xì)胞的活力(P<0.05),見圖3A;FAM3C抗體處理24、48和72 h均能顯著抑制p-Akt蛋白的表達(dá)(P<0.05)，但對(duì)總Akt的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響，見圖3B。

4 腺病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)FAM3C促進(jìn)DOK細(xì)胞的活力

DOK細(xì)胞過(guò)表達(dá)FAM3C(DOK+Ad-FAM3C)24、48和72 h后，F(xiàn)AM3C的mRNA水平均上調(diào)(P<0.05),見圖4A。與對(duì)照(DOK+Ad-GFP)組相比，過(guò)表達(dá)FAM3C(DOK+Ad-FAM3C)可以在48 h和72 h顯著促進(jìn)DOK細(xì)胞的活力(P<0.05),見圖4B，并在24、48和72 h促進(jìn)p-Akt蛋白的表達(dá)(P<0.05)，但對(duì)總Akt的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響，見圖4C。

Figure 2.siRNA-mediatedFAM3Cknockdown (siFAM3C) inhibited the viability of WSU-HN6 cells. A: RT-q PCR was used to detected the FAM3C mRNA expression after siFAM3C treatment for 24, 48 and 72 h; B: WSU-HN6 cell viability detected by CCK-8 assay; C: FAM3C, p-Akt and Akt protein expression after siFAM3C or scramble treatment for 24, 48 and 72 h. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWSU-HN6+scramble group.

圖2siRNA敲減FAM3C抑制WSU-HN6細(xì)胞的增殖

Figure 3.FAM3C antibody (anti-FAM3C) inhibited WSU-HN6 cell viability. A: WSU-HN6 cell viability detected by CCK-8 assay; B: FAM3C, p-Akt and Akt protein expression in WSU-HN6 cells after anti-FAM3C or solvent treatment for 24, 48 and 72 h. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWSU-HN6+solvent group.

圖3抗體封閉FAM3C蛋白抑制WSU-HN6細(xì)胞的活力

討 論

本項(xiàng)工作比較了癌前病變細(xì)胞DOK和口腔鱗癌細(xì)胞WSU-HN6中FAM3C的mRNA 和蛋白的表達(dá)水平，并檢測(cè)到在口腔鱗癌細(xì)胞WSU-HN6中FAM3C的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著高于癌前病變細(xì)胞DOK，這一結(jié)果與最新研究觀察到在患者OSCC組織中FAM3C的表達(dá)顯著高于正常黏膜及上皮異常增生組織一致[7]。此外在乳腺癌、肝癌和胃癌中，也有研究報(bào)道FAM3C在患者的腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[11-13]。由此可見FAM3C表達(dá)的增加可能與OSCC的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)。

Figure 4.Adenovirus-mediated FAM3C overexpression (Ad-FAM3C) promoted DOK cell viability. A: RT-qPCR was used to detected the FAM3C mRNA expression after FAM3C overexpression for 24, 48 and 72 h; B: DOK cell viability detected by CCK-8 assay; C: FAM3C, p-Akt and Akt protein expression after Ad-FAM3C or Ad-GFP treatment for 24, 48 and 72 h. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDOK+Ad-GFP group.

圖4腺病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)FAM3C促進(jìn)DOK細(xì)胞的活力

細(xì)胞活力異常是導(dǎo)致OSCC發(fā)生的一個(gè)重要的原因[14]。本研究在高表達(dá)FAM3C的WSU-HN6細(xì)胞中使用siFAM3C抑制FAM3C mRNA的表達(dá)，在處理48 h后細(xì)胞的活力顯著被抑制，同時(shí)使用抗FAM3C的抗體處理得到了同樣的結(jié)果；而在低表達(dá)FAM3C蛋白的DOK細(xì)胞中使用FAM3C腺病毒過(guò)表達(dá)能顯著提高細(xì)胞活力，提示FAM3C可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞活力參與OSCC的發(fā)生和發(fā)展。另有研究報(bào)道在非轉(zhuǎn)移性的乳腺上皮細(xì)胞EpC40中，過(guò)表達(dá)FAM3C可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]，并可誘導(dǎo)其EMT過(guò)程[16-18]。在乳腺癌和黑色素瘤細(xì)胞中下調(diào)FAM3C的表達(dá)能顯著抑制腫瘤的侵襲和EMT[19]。

本研究中，敲減FAM3C在抑制OSCC細(xì)胞活力的同時(shí)也能抑制Akt的激活，而過(guò)表達(dá)FAM3C則能顯著激活A(yù)kt。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在OSCC患者中，均存在p-Akt水平升高[20-21], 及其與OSCC預(yù)后不良呈正相關(guān)[20]。中國(guó)漢族人群Akt1基因點(diǎn)突變位點(diǎn)與OSCC的發(fā)病率及生存率有關(guān)[22]。p-Akt通過(guò)磷酸化調(diào)控下游cyclin D1、細(xì)胞凋亡蛋白Bad、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑p21Cip1等的表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和生存等多種進(jìn)程[23], 由此推測(cè)FAM3C可能通過(guò)激活A(yù)kt提高OSCC細(xì)胞活力。在胃癌細(xì)胞系中，敲減FAM3C不能影響胃癌細(xì)胞活力，但是卻能激活A(yù)kt并抑制細(xì)胞的遷移及EMT過(guò)程[13]，在腎小管細(xì)胞系HK2中也觀察到FAM3C可能通過(guò)Akt誘導(dǎo)EMT[24]。對(duì)于FAM3C是如何激活A(yù)kt，本課題組既往研究觀察到FAM3C可能通過(guò)熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription factor 1，HSF1)-鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)激活A(yù)kt調(diào)控肝臟的糖脂代謝[9-10]，而對(duì)于FAM3C在OSCC發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中參與到Akt所調(diào)控的具體事件，尚待深入研究。

目前對(duì)FAM3C在OSCC中的研究，僅為其在OSCC患者組織中表達(dá)上調(diào)及與患者預(yù)后的相關(guān)性[7]，尚未見FAM3C參與OSCC的具體機(jī)制研究。本研究首次觀察到FAM3C可能通過(guò)激活A(yù)kt促進(jìn)OSCC細(xì)胞活力，可能是OSCC發(fā)生及發(fā)展的原因之一。本研究可能為今后OSCC的臨床診療及提高OSCC的生存率提供了新參考資料。