尹明姬，李香丹，崔允美，池永學(xué)，李今子

（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科，吉林 延邊 133002）

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，其發(fā)病率與年齡有關(guān)，＜1歲發(fā)病率最高，其次為1～10歲。癲癇的發(fā)病類型眾多，病因非常復(fù)雜，其發(fā)生、發(fā)展及易感的傾向性尚不十分明確[1]。相關(guān)研究顯示，全面性癲癇伴熱性驚厥疊加綜合征的形成可能與GABAARG2基因變異或表達(dá)下調(diào)有關(guān)，而熱性驚厥的易感因素有可能是GABAARG2基因C588T單核苷酸多態(tài)性[2-3]。GABAARG2是γ2的編碼基因，包括9個外顯子和8個內(nèi)含子[4]。癲癇是一種存在遺傳傾向的疾病，但是目前國內(nèi)鮮有研究報道GABAARG2基因多態(tài)性與癲癇關(guān)系。因此，本研究首次通過分析我國北方兒童GABAARG2基因C588T多態(tài)性與癲癇的關(guān)系，為防治癲癇提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月—2018年6月于延邊大學(xué)附屬醫(yī)院兒科門診和/或住院部收治的189例年齡≤12歲的癲癇患兒作為癲癇組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國際抗癲癇聯(lián)盟（International League Against Epilepsy, ILAE）關(guān)于癲癇的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②頭顱MRI檢查（型號：1.5T Multiva，荷蘭皇家飛利浦電子公司）、神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查、癲癇病史等臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①由顱腦外傷、腦出血及腫瘤等顱內(nèi)病變導(dǎo)致癲癇；②合并惡性腫瘤或其他肝腎、精神性嚴(yán)重疾病。根據(jù)ILAE關(guān)于癲癇發(fā)作分類標(biāo)準(zhǔn)，將癲癇組患者分為全面性發(fā)作組和部分性發(fā)作組，分別為82和107例。選取同期于本院兒科門診治療的年齡≤12歲非癲癇兒童113例作為對照組，納入兒童均無癲癇病史、家族史及嚴(yán)重疾病。本研究符合相關(guān)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有兒童是我國北方地區(qū)的漢族人，本研究已獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過，兒童家長均已簽署知情同意書。

1.2 基因組DNA提取

抽取兒童靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管，提取外周血白細(xì)胞的基因組DNA（中國上海賽默飛世爾科技有限公司），于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 單核苷酸多態(tài)性檢測

依據(jù)GABAARG2基因C588T位點(diǎn)上下游序列進(jìn)行正反向引物的設(shè)計，正向引物：5‘-GTGTTCAATC AGAATGTG-3’，反向引物：5‘-CAATCAGAAAG ACTGCG-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用25μl PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)如下：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共37個循環(huán)。所有經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后的PCR產(chǎn)物送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行基因測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析；計數(shù)資料以率（%）或構(gòu)成比表示，比較用χ2檢驗(yàn)；對各組的基因型頻率和等位基因頻率分布進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，分析是否符合Hardy-Weinberg平衡，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者一般資料比較

部分性發(fā)作組男性58例，女性49例；平均年齡（8.0±2.6）歲；平均病程（2.0±1.6）年。全面性發(fā)作組男性49例，女性33例；平均年齡（8.2±3.1）歲；平均病程（3.5+1.1）年。對照組男性61例，女性52例；平均年齡（7.8±3.4）歲。3組患者的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3組患者病程、24 h腦電圖中度以上異常比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），全面性發(fā)作組高于部分性發(fā)作組。見表1。

2.2 GABAARG2基因C588T位點(diǎn)測序結(jié)果

以兒童血液基因組DNA為模板，PCR特異性擴(kuò)增含有GABAARG2基因C588T位點(diǎn)的產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物片段長度為296 bp，并對各組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。見附圖。

2.3 3組患者C588T位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率比較

研究對象GABAARG2外顯子5的C588T多態(tài)位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。3組患者CC、CT和TT基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；3組患者的等位基因C、T頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；部分性發(fā)作組與對照組CC、CT和TT基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.602，P=0.001）；部分性發(fā)作組與對照組等位基因C、T頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.724，P=0.000）；全面性發(fā)作組與對照組CC、CT和TT基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.517，P=0.002）；全面性發(fā)作組與對照組等位基因C、T頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14.536，P=0.000）；全面性發(fā)作組與部分性發(fā)作組CC、CT和TT基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.011，P=0.995）；全面性發(fā)作組與部分性發(fā)作組等位基因C、T頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.012，P=0.912）。見表2。

表1 3組患者一般資料比較

附圖 GABAARG2基因C588T位點(diǎn)測序圖

2.4 不同基因模型下C588T單核苷酸多態(tài)性與兒童癲癇的關(guān)系

癲癇患者中，相比于CC基因型，CT基因型引發(fā)癲癇的風(fēng)險是其2.127倍[（95%CI：1.232，3.615）P=0.000]；而TT基因型引發(fā)癲癇風(fēng)險則更是CC基因型的 3.926 倍 [（95%CI：2.019，7.512），P=0.000]；對患者的等位基因進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，相比于T等位基因，攜帶C等位基因其癲癇患病風(fēng)險提高至2.191倍[（95%CI：1.554，3.094），P=0.000]，表明GABAARG2基因C588T多態(tài)性與癲癇的發(fā)生有關(guān)。

表2 3組患者C588T位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率比較 例（%）

3 討論

兒童和青少年是癲癇的高發(fā)人群，嚴(yán)重危害其身心健康和認(rèn)知功能[6]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，遺傳因素是癲癇發(fā)病的重要影響因素之一，一些基因位點(diǎn)的變化可能提高癲癇發(fā)作的風(fēng)險[7-8]。GABAAR多態(tài)性在癲癇的用藥指導(dǎo)中起著重要作用，其由5個亞基組成的多肽大分子配體門控離子通道受體，由苯二氮卓類藥物識別點(diǎn)、GABA識別點(diǎn)和氯離子門控通道組成，其亞基主要包括：α1、α2、α3、α4、α5、α6、β1、β2、β3、β4、γ1、γ2及γ3等[9]。

動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，GABAAR亞基在抗癲癇藥物敏感的大鼠與耐藥組的大鼠中的表達(dá)存在差異，暗示GABAAR表達(dá)的變化可能與癲癇發(fā)生有關(guān)[10-11]。癲癇發(fā)作往往會改變GABAAR的轉(zhuǎn)運(yùn)及亞基表達(dá)，這些表達(dá)變化與GABAAR亞基類型及患者癲癇發(fā)生的狀態(tài)密切相關(guān)[12-13]。

本研究對我國北方兒童人群中GABAARG2基因單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析，選取≤12歲的癲癇兒童189例，并選取同時期非癲癇患兒113例作為對照組，比較兩組的一般資料發(fā)現(xiàn)，兩組的年齡、性別無差異；全面性發(fā)作組患兒的平均病程高于部分性發(fā)作組；并且全面性發(fā)作組患兒24 h腦電圖中度異常率高于部分性發(fā)作組；3組患者CC、CT和TT基因型頻率及等位基因C、T頻率有差異；部分性發(fā)作組、全面性發(fā)作組與對照組CC、CT和TT基因型頻率及等位基因C、T頻率有差異；而部分性發(fā)作組與全面性發(fā)作組CC、CT和TT基因型頻率及等位基因C、T頻率無差異；對各組患者基因型進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)，在患兒中相比于CC基因型，CT基因型引發(fā)癲癇風(fēng)險是其2.127倍；而TT基因型引發(fā)癲癇風(fēng)險則是CC基因型的3.926倍；對各組的等位基因進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，相比于T等位基因，攜帶C等位基因其癲癇患病風(fēng)險提高至2.191倍，這暗示著GABAARG2 C588T多態(tài)性與癲癇的發(fā)生相關(guān)，其中C等位基因是癲癇患病的高危因素，這與其他學(xué)者研究結(jié)果類似[14-16]。

綜上所述，在我國北方兒童中GABAARG2基因C588T多態(tài)性與癲癇易感性相關(guān)，相比CC基因型，CT和TT基因型均能顯著提高患病風(fēng)險，為理解癲癇的遺傳性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但GABAARG2基因C588T多態(tài)性的作用機(jī)制及與其他基因的相互作用還未十分清楚。