藺廣榮,劉克毅,李紀男,何轉麗,霍建平,柴芳
(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 甲狀腺外科,遼寧 錦州 121001)
近年來,甲狀腺癌的發(fā)病率快速上升,成為最常見的惡性腫瘤之一[1]。其中甲狀腺濾泡癌(follicular thyroid carcinoma, FTC)是繼甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)之后的常見甲狀腺癌,約占10%,轉運途徑以血運轉移為主,易發(fā)生遠處轉移,其侵襲性、轉移率及病死率均高于PTC[2]。根據侵襲程度分為廣泛侵入型甲狀腺濾泡癌(widely invasive follicular thyroid carcinoma, WIFTC)和微小侵入型甲狀腺濾泡癌(minimally invasive follicular thyroid carcinoma, MIFTC),兩者預后差異明顯[3]。熱休克蛋白A9(heat shock protein, HSPA9)是一種高度保守的分子伴侶蛋白,在腫瘤的侵襲、轉移中發(fā)揮重要的作用[4]。Beclin-1屬于自噬相關蛋白,在細胞的自噬過程中起著重要的調控作用。筆者擬對HSPA9、Beclin-1蛋白在FTC中的表達情況進行分析,對其臨床病理意義進行探討,同時分析兩者在FTC中表達的相關性,為臨床尋求新的治療靶點提供依據。
選取2000年1月—2017年12月錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院收治的FTC患者57例,取其癌組織及其癌旁組織(距病灶≤2 cm)。其中,男性18例,女性39例;年齡22~72歲,平均(49.5±18.1)歲。納入標準:①病理診斷由2位高年資的病理醫(yī)生共同確診;②無甲狀腺癌家族遺傳史;③術前未行內分泌治療及放化療;④無合并橋本氏病等甲狀腺相關疾病;⑤臨床分期按照2010年美國癌癥聯(lián)合會分期。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準。
采用免疫組織化學SABC法。組織經10%甲醛固定后脫水、包埋,切片厚度4μm,檢測HSPA9、Beclin-1蛋白表達。一抗均按1∶100稀釋,按試劑盒說明書操作,微波修復,3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶,之后進行血清封閉。依次加入一抗、二抗及SABC,DAB顯色,蘇木精復染,常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封片。PBS取代一抗作為陰性對照。
兔抗人HSPA9(WL03209)、兔抗人Beclin-1(WL02237)單克隆抗體及即用型SABC免疫組織化學染色試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司。
實驗染色結果由2位經驗豐富的病理科醫(yī)生采用雙盲法獨立閱片。根據染色強度和陽性細胞百分比來評分。HSPA9及Beclin-1染色部位均為細胞質或細胞膜。以出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀為陽性表達。強度評分為0(無染色)、1(淺黃色)、2(棕黃色)及3分(棕褐色)。比例積分為0(<5%陽性細胞)、1(5%~<25%陽性細胞)、2(25%~<50%陽性細胞)、3(50%~<75%陽性細胞)和4分(75%陽性細胞)。強度評分和比例積分相乘產生最終的染色評分:0分為陰性(-);1~4分為弱陽性(+);5~8分為陽性(++);9~12分為強陽性(+++)。在統(tǒng)計學分析中,(-)或(+)最后染色評分被合并為陰性表達,(++)或(+++)最后評分被合并為陽性表達。見圖1、2。
圖1 FTC組織中HSPA9和Beclin-1的表達(SABC×400)
圖2 癌旁組織中HSPA9和Beclin-1的表達(SABC×400)
數據分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計數資料以率(%)表示,比較用χ2檢驗或Fisher確切概率法,等級相關分析采用Spearman法檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
FTC組織中HSPA9陽性表達43例(75.44%),癌旁組織中HSPA9陽性表達9例(15.79%),經χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=40.876,P=0.000)。FTC組織中Beclin-1陽性表達35例(61.40%),癌旁組織中Beclin-1陽性表達10例(17.54%),經χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=22.947,P=0.000)。
不同病理類型、是否遠處轉移患者的HSPA9陽性率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);不同病理類型患者的Beclin-1陽性率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見附表。
FTC組織中HSPA9與Beclin-1共同陽性34例,共同陰性13例,HSPA9陽性而Beclin-1陰性9例,HSPA9陰性而Beclin-1陽性1例。HSPA9與Beclin-1蛋白表達呈正相關(rs=0.636,P=0.000)。
附表 HSPA9、Beclin-1蛋白表達與FTC臨床病理參數的關系 例(%)
自噬是溶酶體介導的細胞內分解代謝過程,在營養(yǎng)缺乏、缺氧和DNA損傷的情況下,激活細胞自噬以促進細胞質組分的降解[5]。目前越來越多的文獻支持自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的作用[6-7]。自噬相關蛋白在參與調節(jié)自噬的啟動、延長和成熟的過程中發(fā)揮重要作用。Beclin-1是自噬通路的重要調節(jié)器,與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關。本研究發(fā)現(xiàn),Beclin-1在FTC中陽性表達35例(61.40%),癌旁組織中陽性表達10例(17.54%),兩者比較有差異,進而推測自噬參與FTC的發(fā)生,這一點與既往研究一致[8]。本研究還發(fā)現(xiàn)27例WIFTC患者中Beclin-1陽性表達22例(81.48%),30例MIFTC患者中Beclin-1陽性表達13例(43.33%),兩者比較有差異,提示自噬可能參與FTC的發(fā)展。筆者推測腫瘤的生存狀態(tài)與自噬密切程度有關。隨著腫瘤侵襲力的增強,自噬可能幫助腫瘤細胞擺脫應激環(huán)境,來促進腫瘤的生長。盡管沒有發(fā)現(xiàn)Beclin-1的表達與遠處轉移存在相關性,但是筆者考慮主要與納入的研究對象例數有關。有研究表明,自噬是髓樣癌腫瘤細胞的生存機制[9]。也有學者認為,自噬活性的下降與PTC的發(fā)生與發(fā)展有關[10]。筆者認為自噬在不同病理類型的甲狀腺癌中的發(fā)病機制可能不同。目前自噬相關蛋白在FTC中研究較少,還需要更多的研究驗證自噬在FTC中的發(fā)病機制。
HSPA9是熱休克蛋白70的家族成員之一,在細胞周期調控方面起著重要作用[11-12]。本研究選取18例有轉移的FTC患者,結果陽性率為100%。HSPA9在27例WIFTC患者中陽性表達25例(92.59%),30例MIFTC患者中陽性表達18例(60.00%),兩者比較有差異。筆者推測,HSPA9在FTC侵襲轉移中扮演重要的角色。STARENKI等[13]用免疫組織化學法檢測46例正常甲狀腺組織和38例甲狀腺髓樣癌患者組織中HSPA9的表達情況,發(fā)現(xiàn)在癌組織中表達高于癌旁組織,認為HSPA9可作為甲狀腺髓樣癌的一個新治療靶點。本研究發(fā)現(xiàn),HSPA9在癌組織中表達高于癌旁組織,筆者認為HSPA9也可作為FTC的治療靶點??祻姷萚14]研究發(fā)現(xiàn),通過siRNA沉默HSPA9表達可抑制人肝癌細胞HCCLM3增殖活性,認為HSPA9可以作為肝細胞癌潛在的治療靶點。ANDO等[15]發(fā)現(xiàn),HSPA9不僅可作為胃癌的治療靶點,而且是一個很好的評估胃癌預后的分子。HSPA9參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,并有望成為多種腫瘤的治療靶點。
HSPA9可通過Raf/Mek/Erk1/2信號通路來促進Bcl-2的表達[16]。Bcl-2蛋白通過與自噬相關蛋白Beclin-1共有的BH3結構域相互作用,參與自噬的調控[17]。筆者推測,HSPA9可能通過Raf/Mek/Erk1/2信號通路調節(jié)自噬活性,并參與FTC的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn),HSPA9通過PI3K-Akt和JAK-STAT信號通路加速乳腺癌侵襲與轉移[18]。還有研究發(fā)現(xiàn),HSPA9通過MAPK-ERK信號通路參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展[19]。由此可見,HSPA9參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)。
綜上所述,本研究提示HSPA9和Beclin-1蛋白可能與FTC的發(fā)生、發(fā)展密切相關,為FTC提供新的治療靶點,但其具體機制尚待進一步研究證實。