岳宏程，熊良庚，張建文，林盛，傅少志，劉偉，彭紅菊

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科，四川 瀘州 646000；2.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院 腫瘤科，重慶401320；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)與分子影像四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000）

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）≥80%[1]。放療是NSCLC主要治療措施之一，合適的放療模式可增加腫瘤組織中抗腫瘤淋巴細(xì)胞表達(dá)和細(xì)胞因子含量，增強(qiáng)抗腫瘤作用[2-3]。而單次近距離大分割放療（single brachytherapy hypofractionated radiotherapy, SBHFRT）是否增強(qiáng)腫瘤組織中抗腫瘤淋巴細(xì)胞表達(dá)和細(xì)胞因子含量，目前少有報(bào)道。本研究探討SBHFRT和常規(guī)放療（conventional fractionation radiotherapy, CFRT）對(duì)NSCLC腫瘤組織中淋巴細(xì)胞表達(dá)和細(xì)胞因子含量的影響，為NSCLC放療方案的制定和聯(lián)合免疫治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 荷瘤小鼠模型復(fù)制 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Lewis細(xì)胞株（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科）接種于4、5周齡，體重16～22 g健康C57BL/16雌性小鼠（重慶騰鑫華阜生物科技公司，合格證編號(hào)：11401300024918，SPF級(jí)飼養(yǎng)）右后肢根部皮下。觀察記錄小鼠一般狀態(tài)、體重、成瘤情況及瘤體積變化。待移植瘤直徑達(dá)8～10 mm時(shí)，分成對(duì)照組、CFRT組、SBHFRT組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組12只小鼠。其中6只用于觀察腫瘤體積和代謝情況，其余6只用于淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子的檢測(cè)。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 直線加速器（瑞典Elekta有限公司），石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡儀器有限公司），新型BGZ系列Ⅱ型高精度烤箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），移液器（德國(guó)艾本德公司），倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司），Oncentra brachy TPS近距離治療計(jì)劃系統(tǒng)、Ir192三維后裝近距離治療機(jī)購(gòu)自荷蘭Nucletron Netherlands公司。

1.2 方法

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM高糖培養(yǎng)液（美國(guó)HyClone公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），抗小鼠CD4、CD8、Foxp3單克隆抗體（美國(guó)Bio-world公司），白細(xì)胞介素10（Interleukin-10, IL-10）、白細(xì)胞介素12（Interleukin-12, IL-12）及γ干擾素（Interferon-γ,INF-γ）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京安迪華泰生物科技有限公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 ①CFRT組：Dt=20 Gy/10 d，放射源為6 MV X射線，源皮距100 cm，從接種后第19天開(kāi)始放療，連續(xù)放療5 d后間隔2 d再連續(xù)放療5 d，接種后第30天放療結(jié)束；②SBHFRT組：于接種后第30天開(kāi)始放療，沿腫瘤長(zhǎng)軸方向植入施源器（依腫瘤大小植入1或2根），行模擬定位CT掃描，在Oncentra brachy TPS勾畫(huà)大體腫瘤靶區(qū)，設(shè)計(jì)和實(shí)施放療計(jì)劃（Dt=11.3 Gy/1F，D95%≥10 Gy），只放療1 d。按L-Q模型計(jì)算生物等效劑量（biological equralent dose, BED）（ 腫 瘤 α/β=10），CFRT組 BED=24 Gy，SBHFRT組BED=24.07 Gy，兩者BED基本相同。

1.2.3 CD4+、CD8+及Foxp3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)檢測(cè)放療結(jié)束后第14天，每組處死6只小鼠，完整剝離腫瘤，切取部分腫瘤用于酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)，其余腫瘤組織采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)腫瘤組織中CD4+、CD8+及Foxp3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)，由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生分別獨(dú)立對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行雙盲法評(píng)估。CD4+、CD8+及Foxp3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)：CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞染色為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈棕黃色或褐色，F(xiàn)oxp3+T淋巴細(xì)胞染色為細(xì)胞核呈棕黃色或褐色。CD4+、CD8+及Foxp3+T淋巴細(xì)胞數(shù)計(jì)算方法：每張切片選5個(gè)視野，顯微鏡（400倍）下計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽(yáng)性淋巴細(xì)胞數(shù)，計(jì)算5個(gè)視野陽(yáng)性淋巴細(xì)胞數(shù)平均值即為該切片陽(yáng)性淋巴細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 IL-10、IL-12及INF-γ含量檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)腫瘤組織中IL-10、IL-12及INF-γ含量。具體操作：將腫瘤組織磨碎取上清液，用洗液清洗酶孔板，每孔加樣本稀釋液和檢測(cè)緩沖液，加等量樣本，加檢測(cè)抗體（1∶100），封板震蕩，室溫孵育2 h，洗板，加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素（1∶100），封板震蕩，室溫孵育45 min，洗板，TMB顯色，避光室溫孵育30 min，加終止液。調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450 nm測(cè)定吸光度值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本IL-10、IL-12及INF-γ的含量。

1.2.5 腫瘤體積的測(cè)量和生長(zhǎng)抑制率（tumor growth inhibition rate, TGIR）的計(jì)算 各組從腫瘤接種后第12天開(kāi)始，每隔2 d測(cè)量各組移植瘤最大直徑（a）與最小直徑（b），腫瘤體積（V）：V=a×b2/2。放療后第14天計(jì)算各治療組TGIR。TGIR=（V對(duì)照組-V實(shí)驗(yàn)組）/V對(duì)照組×100%。

1.2.6 腫瘤代謝活性檢測(cè) 放療結(jié)束后第14天，每組選6只小鼠分別行18F-FDG micro PET/CT掃描。18F-FDG micro PET-CT掃描參數(shù)：80 kV；500μA；層距1.5 mm。掃描圖像由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的核醫(yī)學(xué)科醫(yī)師對(duì)18F-FDG PET/CT圖像進(jìn)行分析，計(jì)算腫瘤組織SUV。SUV值高低反映腫瘤代謝活性，即腫瘤SUV值越小表示腫瘤代謝活性越低。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組CD4+、CD8+及Foxp3+ T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平比較

3組CD4+、CD8+及Foxp3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，SBHFRT組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)高于CFRT組和對(duì)照組，而Foxp3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)低于CFRT組和對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1和圖1。

表1 3組CD4+、CD8+及Foxp3+ T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平比較 （n =6，個(gè)，±s）

表1 3組CD4+、CD8+及Foxp3+ T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平比較 （n =6，個(gè)，±s）

組別 CD4+ CD8+ Foxp3+對(duì)照組 34.3±3.3 24.2±4.0 17.5±3.6 CFRT 組 37.3±6.8 39.8±6.6 15.2±3.3 SBHFRT 組 49.2±6.0 71.3±8.2 9.2±1.9 F值 11.892 82.047 12.126 P值 0.001 0.000 0.001

圖1 3組CD4+、CD8+及Foxp3+ T淋巴細(xì)胞的表達(dá) （SP×400）

2.2 3組IL-10、IL-12及INF-γ含量比較

3組IL-10、IL-12及INF-γ含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，SBHFRT組IL-12和INF-γ含量高于CFRT組和對(duì)照組（P＜0.05）；而IL-10含量低于CFRT組和對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 3組腫瘤體積、腫瘤SUV值比較

3組腫瘤體積、腫瘤SUV值比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，SBHFRT組腫瘤體積、腫瘤SUV值低于CFRT組和對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表3和圖2。

2.4 SBHFRT組和CFRT組TGIR比較

SBHFRT組、CFRT組TGIR分別為（37.0±2.5）%和（19.2±3.2）%。兩組TGIR比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.701，P=0.000）；SBHFRT組TGIR高于CFRT組。

表2 3組IL-10、IL-12及INF-γ含量比較（n =6，pg/ml，±s）

表2 3組IL-10、IL-12及INF-γ含量比較（n =6，pg/ml，±s）

組別 IL-10 IL-12 INF-γ對(duì)照組 257.4±65.4 17.4±2.0 184.9±31.6 CFRT 組 219.9±54.1 19.1±1.9 210.8±36.1 SBHFRT 組 135.8±47.6 22.5±2.5 270.7±44.6 F值 7.383 8.702 8.110 P值 0.006 0.003 0.004

表3 3組腫瘤體積、腫瘤SUV值比較 （n =6，±s）

表3 3組腫瘤體積、腫瘤SUV值比較 （n =6，±s）

組別 腫瘤體積/mm3 腫瘤SUV值對(duì)照組 4 169.8±123.3 2.9±0.3 CFRT 組 3 368.7±134.9 2.6±0.2 SBHFRT組 2 627.3±103.4 1.8±0.2 F值 242.935 43.025 P值 0.000 0.000

圖2 3組18F-FDG micro PET-CT掃描圖

3 討論

以立體定向放療（stereotactic body radiotherapy,SBRT）為代表的大分割放療能提高cT3和cT4N0M0期NSCLC患者的2年總生存率（overall survival, OS）和局部控制率[4]。NSCLC行SBHFRT放療研究較少，缺乏基礎(chǔ)性研究。對(duì)臨床NSCLC原發(fā)灶行SBHFRT聯(lián)合縱隔轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)調(diào)強(qiáng)放療研究發(fā)現(xiàn)，其有效率、2年OS分別為92.3%和67%，中位生存期22.5個(gè)月[5]。上述結(jié)果表明，SBHFRT與SBRT能有效提高NSCLC治療的有效率和患者生存期。

腫瘤微環(huán)境的組成和作用十分復(fù)雜[6-7]，對(duì)抗腫瘤免疫有抑制作用[8-10]。研究表明，放療可改變腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子的組成，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)[11-13]。NSCLC腫瘤組織中CD4+、CD8+及Foxp3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)與放療生存期密切相關(guān)，腫瘤組織中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞高表達(dá)，中位生存期和3年生存率均高于低表達(dá)和無(wú)表達(dá)；而Foxp3+T淋巴細(xì)胞低表達(dá)中位生存期和3年生存率均高于高表達(dá)[14-15]。上述研究表明，增加腫瘤組織中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)，降低Foxp3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)，可提高腫瘤患者生存期和生存率。本研究結(jié)果提示，NSCLC行SBHFRT治療相對(duì)于CFRT治療，能有效聚集抗腫瘤淋巴細(xì)胞的能力，和其他學(xué)者報(bào)道類(lèi)似[15-17]。

細(xì)胞因子在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，IL-12能誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，后者可刺激CD8+T淋巴細(xì)胞增值和活化，在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用[18]。IL-10由腫瘤細(xì)胞分泌的一種免疫抑制因子，其不僅可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，還有對(duì)抗FIN-γ作用，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[19]。本研究表明，SBHFRT較CFRT可增加腫瘤組織中IL-12和INF-γ含量，降低IL-10含量，更利于促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)放射線作用。

腫瘤SUV值對(duì)腫瘤代謝情況及預(yù)后評(píng)估具有重要指導(dǎo)意義[20]。本研究通過(guò)PET-CT檢測(cè)各組腫瘤SUV值顯示，放療后SBHFRT組腫瘤代謝低于CFRT組和對(duì)照組；同時(shí)本研究顯示，SBHFRT在控制腫瘤體積和TGIR方面優(yōu)于CFRT組，其機(jī)制可能與SBHFRT增加腫瘤組織中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和IL-12、INF-γ含量，從而增強(qiáng)抗腫瘤作用有關(guān)。

綜上所述，SBHFRT比CFRT更能促進(jìn)肺癌腫瘤組織中抗腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，以及增加具有腫瘤殺傷作用的細(xì)胞因子IL-12和INF-γ含量，更有利于增強(qiáng)放療效應(yīng)。但SBHFRT促進(jìn)腫瘤組織中上述物質(zhì)增加的最佳放療分割劑量，有待進(jìn)一步研究。