陳燕樺，張炳東，何芳，周麗芳，韋祎，謝玉波

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

右美托咪定是一種α2腎上腺素受體激動劑，廣泛用于臨床麻醉和重癥監(jiān)護室的鎮(zhèn)靜[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可以減輕腦缺血再灌注損傷和體外循環(huán)相關(guān)的腦損傷，但其具體機制尚需進一步研究[3-4]。為此，本實驗將右美托咪定用于大鼠體外循環(huán)中，觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡、腦組織含水量、血漿中IL-6和海馬組織cleaved Caspase-3蛋白的表達，探討右美托咪定在體外循環(huán)中的腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠48只，體重250～350 g，采用隨機數(shù)字表法，將其分為3組：假手術(shù)組（S組）、體外循環(huán)組（CPB組）和右美托咪定組（Dex組），每組16只。S組大鼠僅行動靜脈穿刺置管術(shù)，不進行體外循環(huán)轉(zhuǎn)流，120 min后結(jié)束實驗；CPB組行體外循環(huán)轉(zhuǎn)流120 min；Dex組在體外循環(huán)前泵注右美托咪定2.5μg/kg（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），15 min給完，接著在體外循環(huán)轉(zhuǎn)流過程中持續(xù)泵注右美托咪定2.5μg/（kg·h）直至體外循環(huán)轉(zhuǎn)流結(jié)束。

1.2 大鼠體外循環(huán)模型的復制

腹腔注射1%戊巴比妥鈉（北京普博斯生物科技有限公司）0.5 ml/100 g麻醉大鼠，仰臥位固定于實驗臺上，經(jīng)口腔將16 G靜脈留置導管（美國Arrow公司）插入氣管，行機械通氣，潮氣量3 ml/100 g，頻率60次/min，吸呼比為1.0∶1.5，實驗中保持動脈血氣二氧化碳分壓維持在35～45 mmHg。頸前區(qū)、左右腹股溝處刮毛、消毒后縱向切開皮膚，右頸外靜脈置入20 G靜脈穿刺針（北京史密斯醫(yī)療器械有限公司）至右心房，依靠重力引流靜脈血至貯血器（20 ml注射器，山東威高集團醫(yī)用高分子制品股份有限公司）；右股靜脈置入22 G靜脈穿刺針行股靜脈引流；左、右側(cè)股動脈分別置入24 G靜脈穿刺針，右側(cè)股動脈行股動脈灌注，左側(cè)股動脈用于監(jiān)測動態(tài)血壓和行血氣分析。體外循環(huán)采用右股靜脈、右頸外靜脈–右股動脈轉(zhuǎn)流。體外循環(huán)預充液：13 ml同種新鮮肝素化大鼠血液、5 ml乳酸林格液、5 ml 4%羥乙基淀粉溶液（重慶大新藥業(yè)股份有限公司）。靜脈給予肝素鈉（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司）500 u/kg，待激活全血凝固時間（ACT）≥480 s后，使用Stockert Ⅲ型雙頭滾壓泵（德國Stockert Ⅲ公司）和小動物膜肺（東莞科威公司）轉(zhuǎn)流120 min。術(shù)中血氣分析采用i-STAT1血氣分析儀（美國ABBOTT公司），ACT監(jiān)測采用ACT儀（美國Medtroniz公司）。體外循環(huán)期間維持血氣分析數(shù)值在正常范圍，紅細胞壓積約為25%，灌注流量維持在100～120 ml/（kg·min），平均動脈壓維持在75～90 mmHg，鼻咽溫度約36℃。體外循環(huán)轉(zhuǎn)流120 min后實驗結(jié)束。

1.3 ELISA法

每組隨機選取8只大鼠在體外循環(huán)前（T0）、體外循環(huán)1 h（T1）、體外循環(huán)2 h（T2）時采集靜脈血用于測定血漿IL-6濃度。靜脈血標本1 000 r/min離心15 min，采集血漿上清液-20℃保存，最后采用ELISA試劑盒檢測血漿IL-6濃度。

1.4 TUNEL檢測

每組隨機選取8只大鼠，實驗結(jié)束后經(jīng)升主動脈灌注生理鹽水約100 ml至右心耳流出液體為無色，再灌注4℃、4%多聚甲醛（北京百奧萊博科技有限公司）約250 ml，至頭頸部變僵硬。斷頭取腦，常規(guī)石蠟包埋后行連續(xù)冠狀面切片，厚度4μm。按照TUNEL試劑盒（美國Roche公司）說明書步驟進行操作，經(jīng)熒光染色（TUNEL、DAPI、Merge染色）后觀察細胞凋亡情況。細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)較亮的綠色顆粒為陽性細胞，即凋亡細胞。每張切片隨機選取CA1區(qū)3個不同高倍視野（200倍），以平均密度比表示凋亡陽性細胞數(shù)，平均密度比=積分光密度/選定對象的面積，取3次平均值。

1.5 Western blotting檢測

將剩余每組8只大鼠取新鮮海馬組織，按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織蛋白，用BCA法進行蛋白定量。取50μg蛋白加入上樣緩沖液，蛋白變性后進行SDS-PAGE電泳。分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，牛奶封閉2h，TBST洗膜后分別加入兔單克隆抗體cleaved Caspase-3（1∶1 000，美國Cell Signaling Technology公司）和兔抗ACTB多克隆抗體（1∶3 000，美國Bioworlde公司），4℃孵育過夜。TBST洗膜后加入紅外標記的二抗（1∶10 000，美國Cell Signaling Technology公司），室溫下避光孵育2 h，曝光成像。采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜，灰度值用Imaga J軟件測定，以目的蛋白和內(nèi)參β-actin蛋白灰度值比值表示cleaved Caspase-3蛋白的相對表達量。

1.6 腦組織含水量的測定

將每組8只大鼠去掉海馬后的腦組織稱濕重，置于55℃干燥箱內(nèi)烘干24 h至恒重，稱干重。計算腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件。計量資料以均數(shù)±標準差表示（±s），比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間血漿IL-6濃度比較

CPB組、Dex組與 S組 T0、T1、T2的血漿 IL-6濃度比較，采用重復測量設計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的血漿IL-6濃度有差異（F=134.07，P=0.000）；②3組血漿IL-6濃度有差異（F=29.918，P=0.000），CPB 組較 S組高（P＜0.05），Dex組較CPB組低（P＜0.05）；③3組血漿IL-6濃度變化趨勢有差異（F=21.638，P=0.000）。見表1和圖1。

表1 各組大鼠不同時間血漿IL-6濃度比較（n =8，pg/ml，±s）

表1 各組大鼠不同時間血漿IL-6濃度比較（n =8，pg/ml，±s）

注：1）與 S組比較，P ＜0.05；2）與 T0比較，P ＜0.05；3）與CPB組比較，P ＜0.05

組別 T0 T1 T2 S 組 9.42±0.62 10.93±1.59 11.13±1.41 CPB 組 9.95±1.18 17.76±2.771）2） 19.37±2.401）2）Dex 組 9.91±1.67 16. 57±1.191）2） 15.22±1.822）3）

圖1 各組大鼠血漿IL-6濃度的變化趨勢 （n =8）

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡陽性細胞和腦組織含水量比較

免疫熒光染色后，可見凋亡細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)較亮的綠色顆粒，正常細胞核呈藍色。大鼠海馬CA1區(qū)的TUNEL染色圖片中，S組和Dex組可見少量散在綠色顆粒，而CPB組可見較多綠色顆粒（見圖2）。CPB組、Dex組、S組大鼠CA1區(qū)的凋亡陽性細胞數(shù)比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=96.732，P=0.000）；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，CPB組較S組凋亡陽性細胞多（P＜0.05）；Dex組較CPB 組少（P＜0.05）（見表2）。

CPB組、Dex組、S組腦組織含水量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.431，P=0.013）；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，CPB組高于S組（P＜0.05）；Dex組低于CPB組（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)cleaved Caspase-3蛋白表達水平比較

各組大鼠海馬CA1區(qū)cleaved Caspase-3蛋白在17 kD左右出現(xiàn)特異性條帶（見圖3）。CPB組、Dex組、S組海馬組織cleaved Caspase-3蛋白相對表達量分別為（0.89±0.03）、（0.63±0.06）和（0.60±0.06），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=76.244，P=0.000）；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，CPB組高于 S組（P＜0.05）；Dex組低于CPB組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)的凋亡陽性細胞 （熒光染色×200）

表2 各組大鼠CA1區(qū)凋亡陽性細胞和腦組織含水量比較（n =8，±s）

表2 各組大鼠CA1區(qū)凋亡陽性細胞和腦組織含水量比較（n =8，±s）

注：1）與S組比較，P ＜0.05；2）與CPB組比較，P ＜0.05

組別 凋亡陽性細胞（個/mm2） 腦組織含水量/%S組 2.23±0.74 77.07±1.55 CPB組 8.97±1.271） 79.65±1.621）Dex組 5.98±0.812） 77.49±1.862）F值 96.732 5.431 P值 0.000 0.013

圖3 各組大鼠海馬組織cleaved Caspase-3蛋白的表達

3 討論

體外循環(huán)是一種非生理狀態(tài)，血液與體外循環(huán)管道等接觸時可以產(chǎn)生大量炎癥因子，激活補體，引起全身炎癥反應，導致全身組織器官損害[5-6]。體外循環(huán)心臟外科手術(shù)后出現(xiàn)認知功能障礙和腦損傷等[7]，會延長患者術(shù)后恢復時間，增加患者住院日，增加病死率和醫(yī)療費用等，因此減輕體外循環(huán)相關(guān)的腦損傷非常迫切。

研究表明，右美托咪定對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能與右美托咪定減少氧化應激和炎癥反應有關(guān)[8-9]。IL-6是一個重要的促炎因子，可以激活細胞內(nèi)信號傳導通路[10]。Caspase-3是與凋亡相關(guān)的一種調(diào)解蛋白[11]，其激活可以誘導細胞凋亡增多，所以細胞凋亡增加時，可發(fā)現(xiàn)cleaved Caspase-3表達增多[12]。

本研究結(jié)果顯示，體外循環(huán)可以引起大鼠腦組織水腫加重和海馬神經(jīng)元凋亡增多，并且促進IL-6和凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3的表達；使用右美托咪定可以減輕體外循環(huán)導致的大鼠腦組織水腫和減少大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡，下調(diào)炎癥因子IL-6和凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3的表達，說明右美托咪定對大鼠體外循環(huán)有腦保護作用。

綜上所述，體外循環(huán)可以誘導大鼠海馬神經(jīng)元凋亡增多，而右美托咪定可以減輕大鼠體外循環(huán)相關(guān)的腦損傷，其機制可能與其減輕體外循環(huán)相關(guān)的炎癥反應，下調(diào)cleaved Caspase-3蛋白表達有關(guān)。