王朝華，徐 勤，肖慧瓊，袁李禮

(湖南省腦科醫(yī)院心內(nèi)科， 湖南 長沙 410007)

阿霉素(又稱多柔比星，doxorubicin，DOX)是一種蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，應(yīng)用于多種腫瘤的化療方案組合，且效果顯著[1]，但阿霉素的心肌親和力遠高于其它器官，更易造成心肌損傷而限制其臨床應(yīng)用[2]，因此尋找合適的心臟保護策略對抗阿霉素心肌損傷，更有利于其臨床應(yīng)用和療效[3]。丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA，TAN)是唇形科植物丹參的一種脂溶性提取物，能夠明顯提高冠脈流量，改善心肌缺血缺氧，常用于臨床冠心病的治療[4]。研究報道丹參酮ⅡA同樣能拮抗阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷[5]，但具體機制并不明確。近年來，自噬(autophagy)在心血管疾病中的作用日益受到關(guān)注，在不同的心肌病理生理中，自噬可能是一種代償性保護反應(yīng)，也可能引起自噬性死亡[6]。丹參酮ⅡA拮抗阿霉素心肌損傷是否與自噬有關(guān)尚不明確。本實驗擬通過體外研究觀察丹參酮ⅡA對大鼠H9c2心肌細胞損傷、自噬和AMPK活化的影響，并利用抑制劑干預(yù)AMPK水平，從分子水平探討丹參酮 ⅡA可能的調(diào)控機制，為其用于阿霉素心肌損傷的防治提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞、主要試劑與儀器

大鼠H9c2心肌細胞購自上海中國科學(xué)院細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、胰酶、青鏈霉素雙抗和DMSO購自Gibco；胎牛血清購自SERANA；阿霉素和丹參酮ⅡA購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；dorsomorphin購自Selleck；CCK-8檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗LC3、AMPK、p-AMPK抗體和 II 抗購自Sigma；熒光 II 抗購自Invitrogen；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液和多聚甲醛購自武漢谷歌生物科技公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Thermo。二氧化碳培養(yǎng)箱購自Thermo；倒置熒光顯微鏡購自O(shè)lympus；酶標(biāo)儀Biotek；蛋白電泳分離、轉(zhuǎn)膜和成像系統(tǒng)購自Bio-Rad。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) H9c2細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細胞融合度為80%～90%時傳代 1 次，取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞進行實驗研究。

2.2處理試劑配制 將阿霉素、丹參酮ⅡA和dorsomorphin溶于DMSO中制成儲存液避光儲存于-20 ℃，再稀釋成所需工作液濃度進行實驗。

2.3實驗分組 實驗分為2個部分：(1)丹參酮ⅡA對阿霉素處理的心肌 H9c2細胞的影響：對照(control)組、丹參酮ⅡA(10 mg/L TAN)組、阿霉素(5 μmol/L DOX)組和阿霉素+丹參酮ⅡA(5 μmol/L DOX+10 mg/L TAN)組；(2)抑制AMPK后丹參酮ⅡA對阿霉素處理的心肌H9c2細胞的影響：對照(control)組、阿霉素(5 μmol/L DOX)組、阿霉素+丹參酮ⅡA(5 μmol/L DOX+10 mg/L TAN)組、阿霉素+AMPK抑制劑(5 μmol/L DOX+5 μmol/L dorsomorphin)組和阿霉素+丹參酮ⅡA組+AMPK抑制劑(5 μmol/L DOX+10 mg/L TAN+5 μmol/L dorsomorphin)組。

2.4CCK-8法測定細胞活力 將生長狀態(tài)良好的H9c2細胞按每孔5×103個接種于96孔板，依照不同分組進行實驗處理，48 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h后測定490 nm的吸光度(A)值。

2.5LDH法測定細胞損傷 將生長狀態(tài)良好的H9c2細胞按每孔5×103個接種于96孔板，依照不同分組進行實驗處理，48 h后每孔加入10 μL LDH釋放試劑，37 ℃孵育1 h，500×g離心5 min，收集細胞上清100 μL 置新96孔板中，每孔加入50 μL LDH檢測工作液，室溫避光孵育30 min后測定490 nm的A值。

2.6免疫熒光實驗檢測細胞自噬情況 將生長狀態(tài)良好的H9c2細胞按每孔5×105個接種于6孔板，依照不同分組進行實驗處理，48 h后用4%多聚甲醛固定10 min,并細胞穿孔、血清封閉，抗LC3抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，熒光 II 抗(1∶2 000)室溫避光孵育1 h，TBST洗膜3次，封片后熒光顯微鏡觀察拍照，隨機選擇10個視野，分析熒光強度。

2.7Western blot實驗檢測細胞AMPK的活化情況 將生長狀態(tài)良好的H9c2細胞按每孔5×105個接種于6孔板，依照不同分組進行實驗處理，48 h后用RIPA裂解液收集細胞總蛋白，BCA定量后煮沸蛋白變性。取40 μg總蛋白，10%的SDS-PAGE分離蛋白后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h后，抗AMPK(1∶1 000)和p-AMPK(1∶1 000)抗體分別4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，II 抗(1∶5 000)室溫避光孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光后成像系統(tǒng)進行圖像采集及灰度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 5軟件進行圖形繪制。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，LSD-t檢驗進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 丹參酮ⅡA對阿霉素所致H9c2細胞損傷的影響

CCK-8法和LDH檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，阿霉素作用后，H9c2細胞的活力減弱，LDH釋放增多(P<0.05);丹參酮ⅡA處理能恢復(fù)H9c2細胞活力，減少LDH釋放(P<0.05)，見圖1。

2 丹參酮ⅡA對阿霉素所致H9c2細胞自噬的影響

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，阿霉素和丹參酮ⅡA單獨作用后，LC3紅色熒光均增多；阿霉素和丹參酮ⅡA共處理進一步增加LC3紅色熒光強度(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The effects of tanshinone ⅡA (TAN) on the injury of the H9c2 cardiomyocytes induced by doxorubicin (DOX). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX group.

圖1丹參酮ⅡA對阿霉素所致H9c2心肌細胞損傷的影響

Figure 2.The effects of tanshinone ⅡA (TAN) on the autophagy in the doxorubicin (DOX)-induced H9c2 cardiomyocytes (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX group.

圖2丹參酮ⅡA對阿霉素所致H9c2心肌細胞自噬的影響

3 丹參酮ⅡA對阿霉素所致H9c2細胞AMPK活化的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，阿霉素作用后，p-AMPK/AMPK比值降低，AMPK活化被抑制(P<0.05);丹參酮ⅡA處理導(dǎo)致p-AMPK/AMPK比值升高，AMPK活化(P<0.05)，與阿霉素組相比，丹參酮ⅡA+阿霉素組的 AMPK活化程度增加(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The effects of tanshinone ⅡA (TAN) on the activation of AMPK in the H9c2 cardiomyocytes induced by doxorubicin (DOX). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX group.

圖3丹參酮ⅡA對阿霉素所致H9c2心肌細胞AMPK蛋白水平的影響

4 AMPK抑制劑對丹參酮ⅡA抗阿霉素所致心肌 H9c2細胞損傷的影響

CCK-8法和LDH檢測結(jié)果顯示，使用AMPK抑制劑dorsomorphin后，阿霉素所致H9c2細胞的活力減弱和LDH釋放增多無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，但抑制AMPK后丹參酮ⅡA恢復(fù)H9c2細胞活力和減少LDH釋放的作用減弱(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The effects of dorsomorphin on doxorubicin (DOX)-induced injury of H9c2 cardiomyocytes treated with tanshinone ⅡA (TAN). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX group;▲P<0.05vsDOX+TAN group.

圖4Dorsomorphin對丹參酮ⅡA抗阿霉素所致H9c2心肌細胞損傷的影響

5 AMPK抑制劑對丹參酮ⅡA促阿霉素所致H9c2心肌細胞自噬的影響

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，抑制AMPK后，阿霉素所致H9c2細胞的自噬減弱；抑制AMPK后丹參酮ⅡA促進H9c2細胞自噬的作用減弱(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The effects of dorsomorphin on doxorubicin (DOX)-induced autophagy of the H9c2 cardiomyocytes with tanshinone ⅡA (TAN) treatment (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDOX group;&P<0.05vsDOX+TAN group.

圖5Dorsomorphin對丹參酮ⅡA促阿霉素所致H9c2心肌細胞自噬的影響

討 論

心肌損傷是阿霉素最常見且嚴(yán)重的副作用，其心肌毒性機制復(fù)雜，且尚未被完全闡明，但已知涉及氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和細胞凋亡等[7]。丹參酮ⅡA作為傳統(tǒng)中藥丹參的提取物，應(yīng)用于冠心病的輔助治療，研究報道丹參酮ⅡA能拮抗阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷，其機制可能涉及氧化應(yīng)激和凋亡等[8]。最新的研究報道自噬的異常也在阿霉素心肌損傷中發(fā)揮重要作用[9]。自噬被證實在阿霉素心臟損傷中有雙重功能，一方面，自噬能通過降解受損或不需要的蛋白質(zhì)和細胞器并抑制凋亡來增強細胞功能和存活[10]；另一方面，自噬能誘導(dǎo)細胞死亡[11]。但丹參酮ⅡA的保護作用是否與自噬有關(guān)尚不清楚。

本研究利用阿霉素誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞損傷模型，探討丹參酮ⅡA對心肌細胞損傷的影響機制。阿霉素處理后H9c2細胞活力減弱，LDH釋放增多，有明顯損傷。LDH廣泛存在于各種組織中，其中心臟和骨骼肌最為豐富。LDH在心肌細胞受損時釋放入培養(yǎng)液，其漏出量能反映細胞損傷程度[12]。丹參酮ⅡA處理能部分恢復(fù)H9c2細胞活力，減少LDH釋放，說明丹參酮ⅡA能減輕心肌細胞損傷。同時，我們檢測了細胞自噬水平的變化，免疫熒光檢測結(jié)果顯示，阿霉素處理后H9c2細胞自噬增加，而丹參酮ⅡA處理進一步增加細胞自噬。自噬作為一個高度保守的生物學(xué)過程，近年來，其在心血管疾病中的作用日益受到關(guān)注，許多心臟疾病(如心肌肥厚、心肌疾病和缺血性心臟病)的心肌病理變化過程中都存在自噬的異常[13]。研究表明死亡的心肌細胞中常見存在大量自噬體，阿霉素心肌損傷的研究也發(fā)現(xiàn)自噬途徑的異常激活[14]，這與我們實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的一致。丹參酮ⅡA被報道能夠促進自噬抗內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷[15]，而本研究中發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA同樣也能促進H9c2細胞的自噬。丹參酮ⅡA可減輕阿霉素所致H9c2心肌細胞損傷，且此作用可能與誘導(dǎo)細胞自噬有關(guān)，其具體機制有待進一步深入研究。

AMPK是細胞能量感知和細胞信號調(diào)控的一個重要的激酶[16]，其作為能量感受信號中轉(zhuǎn)站，將細胞內(nèi)的能量信號匯聚于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)。磷酸化激活的AMPK可以通過磷酸化抑制mTORC1繼而增強自噬[17]。 我們的結(jié)果顯示阿霉素能夠抑制H9c2心肌細胞AMPK的磷酸化，這與Gratia等[18]研究發(fā)現(xiàn)一致；而丹參酮ⅡA能誘導(dǎo)H9c2心肌細胞AMPK的磷酸化。本實驗通過AMPK抑制劑dorsomorphin阻斷AMPK激活，能夠部分抑制丹參酮ⅡA誘導(dǎo)的自噬，進一步導(dǎo)致細胞活力減弱，LDH釋放增多，說明丹參酮ⅡA通過AMPK信號通路上調(diào)自噬，進而減輕阿霉素所致H9c2心肌細胞損傷。

綜上所述，丹參酮ⅡA可能通過調(diào)控AMPK信號通路，誘導(dǎo)H9c2心肌細胞自噬，發(fā)揮其減輕阿霉素心肌細胞損傷的生物學(xué)活性，進而防治阿霉素心肌毒性的發(fā)生發(fā)展。