楊艷秋，劉 森，王 丹，劉家欣，李文章，王沛堅△

(成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 1科技部， 2心血管內(nèi)科， 3衰老與血管穩(wěn)態(tài)四川省高等學校重點實驗室， 四川 成都 610500)

基于對血管的損害，糖尿病(diabetes mellitus，DM)可導致心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。流行病學數(shù)據(jù)表明，約70%～80%的DM患者最終死于相關(guān)的心腦血管并發(fā)癥[1]。DM損害心腦血管系統(tǒng)的機制涉及氧化應激、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活、炎癥、晚期糖基化終產(chǎn)物堆積及DNA和組蛋白甲基化在內(nèi)的表觀遺傳途徑等[2]。EMPA-REG OUTCOME研究結(jié)果發(fā)布之前的ACCORD、ADVANCE、UKPDS和VADT等研究均未證實降糖治療能顯著改善DM患者的心腦血管預后，鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運體2(sodium-glucose linked transporter 2，SGLT-2)抑制劑恩格列凈為DM患者降低心腦血管風險，改善預后帶來了希望，但仍存在一定的爭議[3-5]。

DASH飲食和地中海飲食等研究探索了飲食和生活方式對心腦血管疾病的作用[6]。綠原酸(chlorogenic acid，CGA)主要來源于我國傳統(tǒng)中藥金銀花和杜仲，此外，咖啡豆中也含有豐富的CGA[7]。近年大量關(guān)于CGA的研究表明其具有廣泛的藥理活性，基于其抗氧化和抗炎等作用，CGA在抗腫瘤、抗菌、調(diào)脂、降壓、降糖及保護心血管系統(tǒng)等方面展現(xiàn)了顯著的作用[8]。鑒于CGA對血糖的影響、抗氧化應激的活性及其對血管活性的調(diào)節(jié)作用，我們推測CGA可改善DM相關(guān)的血管內(nèi)皮功能障礙。為此，我們利用肥胖型2型DMdb/db小鼠觀察飲食中添加CGA對DM血管內(nèi)皮功能障礙的影響，并初步分析其機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與分組處理

雄性db/db小鼠(6周齡，12只)購于南京大學模式實驗動物中心，合格證編號為SCXK(蘇)018-0008,分為對照(control)組(給予普通飼料喂養(yǎng))和CGA膳食干預(CGA)組(飼料中含0.02% CGA)[9]，每組6只小鼠，實驗開始前，先進行適應性飼養(yǎng)1周，實驗開始后的每周均觀察空腹血糖、體重和鼠尾血壓，觀察的周期為12周。實驗結(jié)束時在以4%水合氯醛麻醉后頸動脈取血，分離胸主動脈進行相關(guān)實驗。動物實驗符合成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會相關(guān)章程的要求。

2 主要試劑和儀器

綠原酸(純度≥98%；Cayman)；二氫乙啶(dihydroethidium， DHE)、4,5-二氨基熒光素二乙酸酯(4，5-diaminofluorescein diacetate，DAF-2 DA)、苯腎上腺素(phenylephrine，PE)、硝酸甘油(nitroglycerin，NTG)和乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)等試劑均購于Sigma；測定血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、醌NADP(H)脫氫酶1[NAD(P)H dehydrogenase quinone 1，NQO1]和谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase-1，GPx-1)的試劑盒購于南京建成生物工程研究所；抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、p-eNOS、磷酸化的AMP活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase，p-AMPK)、過氧化物酶體增生物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPARα)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)、P22phox和P47phox抗體均購于Santa Cruz。620M微血管張力測定儀(Wire Myograph System;DMT)；BP-98A小鼠無創(chuàng)血壓計(Softron)；血糖儀及血糖試紙(美國強生)。

3 主要方法

3.1血液標本的處理 頸動脈取EDTA抗凝血，3 000 r/min 離心15 min 后取血漿以ELISA 法測HO-1、CAT、NQO1和GPx-1水平，具體操作按試劑盒說明書進行。

3.2超氧陰離子的DHE染色觀察 參照既往方法[10]，按說明書以DMSO溶解DHE配制成0.01 mmol/L的母液，4 ℃避光保存。臨用前于Krebs溶液中稀釋成工作液，37 ℃孵箱中避光染色30 min，用Krebs溶液清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察拍照。Krebs液組成(mmol/L)：NaCl 119, KCl 4.7, CaCl22.5, MgSO41.2, KH2PO41.2, NaHCO325, glucose 11.1, pH 7.35～7.45。

3.3NO的DAF-2 DA染色觀察 參照DHE染色液的配制方法，在干預后的血管內(nèi)皮細胞中加入終濃度為5 mmol/L的DAF-2 DA, 37 ℃避光孵育30 min。用Krebs液清洗3次后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

3.4胸主動脈血管功能的測定 參照既往建立的方法[10]，觀察用PE預收縮后，ACh介導的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應和NTG介導的非內(nèi)皮依賴性舒張反應。計算方法：舒張反應(%)，某一藥物濃度所引起的最大舒張幅度與血管收縮劑引起的最大收縮幅值之比值，以百分比表示。將數(shù)據(jù)輸入GraphPad Prism 5.0軟件，制作擬合曲線，通過軟件計算最大舒張反應(Emax)進行比較。

3.5Western blot 分析相關(guān)蛋白分子的表達 參照既往建立的方法[11]，以Bradford法進行蛋白定量后進行Western blot操作，檢測p-AMPK、Nrf2、PPARα、eNOS、p-eNOS、P22phox和P47phox的蛋白水平。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。動物實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05有統(tǒng)計學意義。所有統(tǒng)計結(jié)果均使用GraghPad Prism 5.0軟件作圖。

結(jié) 果

1 CGA對小鼠血糖及體重的影響

與control組比較，CGA組在第11周末開始，體重及空腹血糖均顯著降低(P<0.05), 這種情況在12周末實驗結(jié)束時依然延續(xù)(P<0.01或P<0.05),見圖1。

Figure 1.The effects of CGA on the changes of body weight and fasting blood glucose in thedb/dbmice. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1CGA對db/db小鼠體重及空腹血糖的影響

2 CGA對db/db小鼠血漿HO-1、CAT、NQO1和GPx-1水平的影響

以ELISA法觀察了膳食CGA對db/db小鼠血漿中機體抗氧化酶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGA顯著增加db/db小鼠血漿中HO-1、CAT、NQO1和GPx-1的水平(P<0.05 或P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effects of CGA on the plasma levels of HO-1, CAT, NQO1 and GPx-1 in thedb/dbmice. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2CGA對db/db小鼠血漿HO-1、CAT、NQO1和GPx-1水平的影響

3 CGA對db/db小鼠血管內(nèi)膜超氧陰離子及NO的影響

DHE染色發(fā)現(xiàn)，給予12周飲食CGA干預的db/db小鼠血管內(nèi)膜中的超氧陰離子水平顯著低于control組(P<0.01)；DAF-2 DA染色發(fā)現(xiàn)，與control組比較,CGA可顯著增加db/db小鼠血管內(nèi)膜中NO水平(P<0.01),見圖3。

Figure 3.The effects of CGA on superoxide anion and NO levels in endothelium ofdb/dbmice aorta. A: CGA administration decreased superoxide anion (red) level in thedb/dbmice aorta; B: dietary CGA increased NO (green) levels indb/dbmouse endothelium. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖3CGA對db/db小鼠胸主動脈內(nèi)膜超氧陰離子及NO水平的影響

4 CGA對db/db小鼠血壓及血管內(nèi)皮功能的影響

鼠尾血壓監(jiān)測提示，與control組小鼠比較，CGA干預未能顯著降低小鼠的血壓水平。但離體血管功能評價顯示，CGA干預后可顯著改善db/db小鼠胸主動脈乙酰膽堿誘導的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能，對硝酸甘油誘導的非內(nèi)皮依賴性舒張功能無顯著影響,見圖4。

Figure 4.The effects of CGA on the blood pressure and vasorelaxation in thedb/dbmice. A and B: the effects of CGA on systolic blood pressure (SBP) and diastolic blood pressure (DBP) after 12 weeks of administration; C and D: dietary CGA improved ACh-induced endothelium-dependent relaxation but not endothelium-independent relaxation. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4CGA對db/db小鼠血壓及血管功能的影響

5 CGA對血管組織相關(guān)分子表達的影響

以Western blot 檢測了2組小鼠胸主動脈組織中p-AMPK、Nrf2、PPARα、eNOS、p-eNOS、P22phox和P47phox的蛋白水平，結(jié)果顯示，與control組比較，CGA可上調(diào)胸主動脈PPARα、Nrf2、p-AMPK和p-eNOS的蛋白水平，降低P22phox和P47phox的蛋白水平(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

Figure 5.Effects of CGA on related protein expression indb/dbmice aorta. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5CGA對db/db小鼠胸主動脈組織相關(guān)分子表達的影響

討 論

在本研究中，我們以目前最常用的肥胖型DM小鼠觀察CGA對DM血管內(nèi)皮功能障礙的作用及對相關(guān)機制進行了初步的探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在飲食中添加CGA可顯著降低體重及空腹血糖，增加血漿中抗氧化物酶的水平，減少血管內(nèi)膜超氧陰離子的生成，增加NO水平，改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能。Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGA可增加血管組織中PPARα、Nrf2和p-AMPK等信號通路分子蛋白的表達。

既往研究發(fā)現(xiàn)CGA可顯著改善高血壓患者的血管內(nèi)皮功能、保護腦的缺血再灌注損傷[7, 12-13]，但對DM相關(guān)血管內(nèi)皮功能障礙的作用及相關(guān)的機制未見有相關(guān)的研究報道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CGA可顯著改善db/db小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能，但對血壓無顯著的降低作用?；谄鋵ρ趸瘧に降挠绊懀覀兺茰y其改善血管內(nèi)皮功能的作用與其抗氧化的作用有關(guān)。

有研究表明，CGA可顯著上調(diào)肝臟中PPARα表達水平從而增加脂肪酸的利用，改善脂質(zhì)代謝，減輕非酒精性脂肪肝，降低心血管風險[14]。敲除PPARα的小鼠血管內(nèi)皮功能受損，而氧自由基清除劑tempol可顯著修復內(nèi)皮功能，提示PPARα的缺失導致的血管內(nèi)皮功能障礙歸因于氧化應激[15]，提示PPARα可能為CGA改善DM血管內(nèi)皮功能障礙的作用靶點。

在急性肝損傷中，CGA可顯著上調(diào)Nrf2的表達，從而減輕急性肝臟損害[16]。而在既往的研究中，Nrf2被認為是治療DM相關(guān)心腦血管并發(fā)癥的一個重要靶點[17]。另有研究表明，在DM模型中，CGA通過激活AMPK通路具有抗DM和相關(guān)肢體缺血的作用，但具體機制仍不明確[18]。根據(jù)目前的研究，我們以CGA干預db/db小鼠后，獲取血管組織，以Western blot觀察了CGA對血管組織中上述分子表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGA可顯著上調(diào)PPARα、Nrf2和AMPK的蛋白水平，同時下調(diào)P22phox和P47phox的表達。為此，我們初步認為CGA改善DM血管內(nèi)皮功能的作用與其抗氧化應激有關(guān)，在分子機制層面上，我們認為可能與PPARα、Nrf2和AMPK有一定的聯(lián)系。

綜上，本實驗證實了CGA通過減輕氧化應激水平，改善血管內(nèi)皮功能的效應。雖然利用血管組織觀察到CGA對PPARα、Nrf2和AMPK的作用，且在既往的研究中，PPARα、Nrf2和AMPK三者間亦存在密切的聯(lián)系[19-20]，但上述信號分子在CGA改善DM相關(guān)血管內(nèi)皮功能障礙中是否有密切的聯(lián)系，仍需結(jié)合細胞實驗及相關(guān)的基因敲除動物實驗進一步證實。