羅 斌，鄭 茜，王林琪，邰 燁，唐俊明，陳 晉

(湖北醫(yī)藥學(xué)院 1生理學(xué)教研室， 2藥護(hù)學(xué)院, 3口腔學(xué)院， 4公共衛(wèi)生與管理學(xué)院， 湖北 十堰 442000)

大量研究表明，心力衰竭(heart failure，HF)的發(fā)病及預(yù)后與心臟的自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān)，是交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度活躍及副交感神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)異常低下所引起的綜合癥狀[1-3]。在HF患者體內(nèi)，尿兒茶酚胺和血漿去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)水平明顯升高，交感神經(jīng)緊張性增強(qiáng)及心血管反射異常[1, 4-5]。NE主要是由交感節(jié)后神經(jīng)元合成和分泌的一種神經(jīng)遞質(zhì)，其通常負(fù)責(zé)對(duì)機(jī)體受到應(yīng)激時(shí)作出反應(yīng)[3]，在誘導(dǎo)心臟發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)中，NE會(huì)引起心肌肥大甚至心肌細(xì)胞凋亡[6]。

因此，改善自主神經(jīng)系統(tǒng)功能失衡成為缺血性心肌保護(hù)的一個(gè)重要研究方向。研究證實(shí)，在心肌缺血發(fā)生前后的不同時(shí)點(diǎn)刺激迷走神經(jīng)以增加其末梢遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)的合成與釋放，均能夠產(chǎn)生有效的心肌保護(hù)作用[7-9]。目前，通過(guò)刺激迷走神經(jīng)治療HF的機(jī)制研究仍處于初級(jí)階段[10-11]，因此，本實(shí)驗(yàn)建立NE誘導(dǎo)心肌 H9c2細(xì)胞凋亡的模型，觀察ACh對(duì)NE誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞凋亡的影響，研究ACh可能通過(guò)哪種信號(hào)分子發(fā)揮作用，為HF等心臟疾病提供新的治療靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和主要試劑

心肌H9c2細(xì)胞株由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所提供。磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和胰蛋白酶(Gibico)；阿托品、ACh、NE和MTT(Sigma)；PI3K/AKT信號(hào)分子阻斷劑LY294002、 ERK1/2信號(hào)分子阻斷劑 PD98059、p38 MAPK信號(hào)分子阻斷劑SB203580和核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)分子阻斷劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)均購(gòu)自碧云天；Annexin-V-FLUOS 染色試劑盒和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)試劑盒(Roche)；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1染色；Life Technologies)。

2 方法

2.1H9c2細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃的溫箱條件下培養(yǎng)。建立NE誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、ACh保護(hù)細(xì)胞模型及藥物干預(yù)時(shí)，培養(yǎng)基改為2%胎牛血清培養(yǎng)。分別選取NE濃度為0、5、10和20 μmol/L，處理24 h，確定細(xì)胞凋亡損傷模型的最適NE濃度。

為了確定最適ACh濃度，將H9c2細(xì)胞分別用濃度為0、0.1、1和10 μmol/L 的ACh預(yù)處理1 h后，用 PBS 洗2遍，再添加NE 于培養(yǎng)基中作用24 h。其次，再次確定ACh是否有保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)分為6組：對(duì)照(control)組；NE(10 μmol/L)組；ACh(10 μmol/L)組；ACh+NE組；阿托品(100 μmol/L)+NE組；阿托品+ACh+NE組。阿托品于添加ACh前1 h加入。

為了研究ACh的作用機(jī)制，使用阻斷劑預(yù)處理1 h后再用ACh預(yù)處理1 h，之后添加NE于培養(yǎng)基作用 H9c2細(xì)胞作用24 h，將H9c2細(xì)胞分為8組：(1)對(duì)照組；(2)NE組；(3)ACh+NE組；(4)阿托品+ACh+NE組；(5)LY294002(10 μmol/L)+ACh+NE組；(6)PD98059(50 μmol/L)+ACh+NE組；(7)SB203508(30 μmol/L)+ACh+NE組；(8)PDTC(50 μmol/L)+ACh+NE組。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將 H9c2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)孔面積80%時(shí)，用上述分組的不同因素處理后，加入MTT(5 g/L)置于培養(yǎng)箱孵育4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜,每孔200 μL，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組吸光度(A)值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力：細(xì)胞相對(duì)活力(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

2.3JC-1染色測(cè)定線粒體膜電位 將H9c2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積約80%時(shí)，按照上述各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素作用后，用 PBS 洗1次，加入0.2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液和0.2 mL JC-1染色工作液，充分混合后在37 ℃孵育20 min，然后吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。在熒光倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)拍攝紅色與綠色熒光圖片，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析5個(gè)視野紅色熒光強(qiáng)度平均值(red mean fluorescence intensity,RMFI)與綠色熒光強(qiáng)度平均值(green mean fluorescence intensity, GMFI)的比值，然后對(duì)每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS生成 將 H9c2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積約80%時(shí)，按照上述各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素作用后，消化、收集細(xì)胞和上消化液，離心后棄上清液，PBS 洗1次，加入不含血清的EDTA及10 μmol/L的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min(每3 min混勻1次，使探針和細(xì)胞充分接觸)，離心棄上清，PBS 洗3次，再加入1 mL PBS重懸后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果以與對(duì)照組的熒光強(qiáng)度比例的百分率表示，圖中峰值右移，代表平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，ROS相對(duì)含量增多。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將 H9c2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積約80%時(shí)，按照上述各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素作用后，消化、收集細(xì)胞和上消化液，離心后棄上清液，PBS 洗1次，加入Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-FITC混勻后，加入PI混勻，室溫、避光、反應(yīng)10 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光。CellQuest 軟件分析結(jié)果，結(jié)果以凋亡細(xì)胞的百分率表示，即右上象限(晚凋)+右下象限(早凋)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法檢測(cè)NE和ACh對(duì)細(xì)胞活力的影響

選取濃度為0、5、10和20 μmol/L的NE處理H9c2細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，隨著NE干預(yù)濃度的增加(從10 μmol/L開(kāi)始)，細(xì)胞活力顯著降低，并低于50%，呈明顯的劑量依賴關(guān)系(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。因此，選擇10 μmol/L作為NE的損傷濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

選取濃度為0、0.1、1和10 μmol/L 的ACh預(yù)處理H9c2細(xì)胞1 h，后加入NE(10 μmol/L)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，結(jié)果顯示，10 μmol/L的ACh作用最大，可使細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。因此，選擇10 μmol/L作為ACh的最適濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1.The viability of the H9c2 cells treated with NE and ACh at different doses was measured by MTT assay. A: the H9c2 cells were treated with different doses of NE for 24 h; B: the H9c2 cells were treated with different doses of ACh for 1 h and then 10 μmol/L NE for 24 h. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vsNE (10 μmol/L) group．

圖1MTT法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NE和ACh對(duì)心肌H9c2細(xì)胞活力的影響

2 激光共聚焦成像觀察JC-1法測(cè)定的線粒體膜電位的變化

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件，紅色提示膜電位正常，綠色提示膜電位降低，通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變(RMFI與GMFI的比值降低)可以很容易地檢測(cè)到線粒體細(xì)胞膜電位的下降。與NE 組比較，ACh+NE組的線粒體細(xì)胞膜電位上升(P<0.05)；與ACh+NE組比較，阿托品+ACh+NE組線粒體細(xì)胞膜電位下降(P<0.05)。若在ACh預(yù)處理之前，分別加入PI3K信號(hào)分子阻斷劑、ERK1/2信號(hào)分子阻斷劑、p38 MAPK信號(hào)分子阻斷劑和NF-κB信號(hào)分子阻斷劑，與ACh+NE組比較，只有加入NF-κB信號(hào)分子阻斷劑組的線粒體膜電位明顯降低(P<0.05)，其余3組與ACh+NE組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS生成

細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇可以氧化無(wú)熒光的DCFH而生成有熒光的DCF，流式圖中峰值右移代表ROS含量增多。與NE 組比較，ACh+NE組的ROS含量明顯下降(P<0.05)；與ACh+NE組比較，阿托品+ACh+NE組的ROS含量增加(P<0.05)。若在ACh預(yù)處理之前，分別加入PI3K信號(hào)分子阻斷劑、ERK1/2信號(hào)分子阻斷劑、p38 MAPK信號(hào)分子阻斷劑和NF-κB信號(hào)分子阻斷劑，與ACh+NE組比較，加入NF-κB信號(hào)分子阻斷劑組的ROS含量明顯增加(P<0.05)，其余3組的ROS含量與ACh+NE組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3。

Figure 2.JC-1 staining was used for determining the changes of mitochondrial membrane potential (×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsACh+NE group.

圖2激光共聚焦成像檢測(cè)心肌H9c2細(xì)胞的線粒體膜電位水平

4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡

Annexin V-FITC/PI染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞的凋亡率。與NE 組比較，ACh+NE組的細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)；與ACh+NE組比較，阿托品+ACh+NE組的細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。若在ACh預(yù)處理之前，分別加入PI3K信號(hào)分子阻斷劑、ERK1/2信號(hào)分子阻斷劑、p38 MAPK信號(hào)分子阻斷劑和NF-κB信號(hào)分子阻斷劑，與ACh+NE組比較，加入NF-κB信號(hào)分子阻斷劑組的細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，其余3組的細(xì)胞凋亡率與ACh+NE組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖4。

Figure 3.DCFH staining analysis for ROS level in the H9c2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsACh+NE group.

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌H9c2細(xì)胞內(nèi)的ROS水平

討 論

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的主動(dòng)有序的細(xì)胞自我消亡過(guò)程，在心肌缺血、心肌梗死及心力衰竭等心血管疾病的病理過(guò)程中廣泛參與。若能阻止或減少凋亡，對(duì)于減輕由于細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的心臟功能的減退，在多種心血管疾病的治療中有著重要意義[12]。

大量研究表明，心力衰竭是交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度活躍及副交感神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)異常低下所引起的綜合癥狀[1-3]。在心力衰竭患者體內(nèi)，尿兒茶酚胺和血漿去甲腎上腺素水平明顯升高。在誘導(dǎo)心臟發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)中，NE會(huì)引起心肌肥大甚至心肌細(xì)胞凋亡[6]。1998年 Communal等[13]應(yīng)用成年大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)模型，證實(shí)高濃度NE可引起心肌細(xì)胞凋亡。在心肌缺血發(fā)生前后的不同時(shí)點(diǎn)刺激迷走神經(jīng)以增加其末梢遞質(zhì)ACh的合成與釋放，均能夠產(chǎn)生有效的心肌保護(hù)作用[7-9]。本研究使用高濃度(10 μmol/L)的NE處理心肌 H9c2細(xì)胞，模擬HF發(fā)生發(fā)展過(guò)程中高兒茶酚胺類激素的微環(huán)境，觀察ACh(10 μmol/L)預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用。與既往報(bào)道一致，高濃度NE可明顯損傷心肌 H9c2細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率降低、線粒體膜電位丟失、ROS生成增多及細(xì)胞凋亡率顯著增加；經(jīng)ACh預(yù)處理后，細(xì)胞存活率升高、ROS生成減少，也抑制了線粒體膜電位丟失及細(xì)胞凋亡。阿托品為經(jīng)典的競(jìng)爭(zhēng)性M型膽堿受體阻斷劑，能阻斷ACh或膽堿受體激動(dòng)藥與受體結(jié)合，拮抗其對(duì)M受體的激動(dòng)效應(yīng)。我們觀察到，在加入阿托品(100 μmol/L)后，可顯著降低ACh對(duì)心肌H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用。

Figure 4.The cell apoptotic rate was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsACh+NE group.

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌H9c2細(xì)胞的凋亡水平

雖然我們已經(jīng)知道上調(diào)迷走神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性或增加ACh的釋放，均能夠產(chǎn)生有效的心肌保護(hù)作用，但其具體機(jī)制仍然沒(méi)有完全研究清楚。李冬玲等[14]和吳濤等[15]認(rèn)為，迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)ACh是膽堿能抗炎和抗凋亡通路的重要組成成分，提高迷走張力或增加ACh的釋放可通過(guò)活化α7nAChR及其下游信號(hào)分子發(fā)揮對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用。在細(xì)胞內(nèi), 多種信號(hào)分子可參與炎性因子與凋亡因子的表達(dá)，如ROS、NF-κB、p38 MAPK及AKT等[14， 16]。

為了進(jìn)一步研究ACh發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制，在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們?cè)贏Ch預(yù)處理時(shí)，分別加入了與凋亡及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的4種信號(hào)通路分子阻斷劑： PI3K/AKT信號(hào)分子阻斷劑LY294002、 ERK1/2信號(hào)分子阻斷劑PD98059、p38 MAPK信號(hào)分子阻斷劑SB203580和NF-κB信號(hào)分子阻斷劑PDTC進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有加入NF-κB阻斷劑后ACh的保護(hù)作用顯著減弱。

從以上結(jié)果我們推測(cè)，ACh可以抑制高濃度的NE誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)NF-κB信號(hào)分子介導(dǎo)的。此外，離體細(xì)胞模型與在體模型存在差異，因此，本課題組擬在心肌梗死動(dòng)物模型開(kāi)展進(jìn)一步的研究。