陳汝，冉昆，王傳增，薛曉敏，王金政

（山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

蘋果是山東省種植規(guī)模最大的優(yōu)勢果品，其中紅富士是主栽品種之一，種植面積約占70%?？茖W防治病蟲害關(guān)系著蘋果產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)可持續(xù)發(fā)展[1]。蘋果膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides） 是蘋果的主要侵染性病害之一，可引起蘋果生長期和貯藏期的產(chǎn)量與品質(zhì)損失[2～4]。使用化學殺菌劑易帶來病原菌抗藥性增加、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題[5]。而生物防治具有安全、環(huán)保等特點，因此備受關(guān)注。酵母菌具有抗逆性強、耐貧瘠、繁殖速度快、不產(chǎn)生毒素等優(yōu)點，在生物防治植物病害中具有廣闊的應用前景[6～8]，因此篩選高度抑制蘋果炭疽病菌的拮抗菌對生物防治該病害尤為重要。自然界中，海水、土壤以及植物的葉片、根系、果實表面等廣泛附著具有代表性的酵母菌群[9]，蘋果園中亦含有大量的酵母菌種資源[10，11]。研究表明，能有效抑制蘋果果實病害的生防酵母菌有Rhodotorula glutinis、Metschnikowia pulcherrima、Pichia caribbica 等[12～14]。拮抗酵母菌的作用機制主要包括營養(yǎng)與空間的競爭、誘導寄主抗病性以及直接的寄生作用等[6，7]。果實表面的酵母菌與病原菌在同一生境位置，并且有效定殖、適應能力強，是篩選高效生防酵母菌的首選[15～17]。從紅富士果實表面分離、純化酵母菌，篩選其中對蘋果炭疽病菌抑制效果較好的拮抗酵母，并對其進行分子學鑒定，旨為蘋果炭疽病害生物防治的研究和應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘋果炭疽病菌由山東省果樹研究所提供，病原菌株編號為Acg1，采用組織分離法從具有炭疽病癥狀的紅富士果實樣品中分離、純化、鑒定并保藏[18]。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的分離、純化 采集成熟健康的紅富士蘋果，采用稀釋分離法[11]從蘋果果實表面分離、純化酵母菌株19 株。稱取果皮1 g，加入液體富集培養(yǎng)基（酵母浸粉10.0 g/L、蛋白胨20.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、氯霉素200 μg/mL） 10 mL 置于50 mL 三角瓶中搖勻，25 ℃下150 轉(zhuǎn)/min 培養(yǎng)2 d 后稀釋涂布YPD 平板（氯霉素200 μg/mL）。25 ℃下培養(yǎng)2～3 d，挑取形態(tài)不同的菌落，平板劃線純化后轉(zhuǎn)接斜面。根據(jù)菌落質(zhì)地、顏色、邊緣和其他表面特征等進行形態(tài)學的初步歸類[19]。4 ℃下短期保存或者置于20%甘油管中-80 ℃冰箱中保存，待用。

1.2.2 拮抗酵母菌的篩選 采用平板對峙法進行。首先，將蘋果炭疽病菌株Acg1 置于28 ℃的PDA 平板上活化培養(yǎng)72 h，用打孔器制成直徑為5 mm 的菌片；然后，將菌片移植轉(zhuǎn)接到新的PDA 平板中央，菌絲面朝下；最后，用接種環(huán)挑取少量活化好的酵母菌株，沿病原菌菌片四周對稱等距離劃直線，以平板中央只接種病原菌菌片而不接種待測酵母菌株的平板為對照。28 ℃下培養(yǎng)4 d，觀察并記錄病原菌的菌落直徑（十字交叉法）。每個酵母菌種處理重復3 次，計算抑菌率〔CK 菌落直徑-處理菌落直徑） /CK 菌落直徑×100%〕。

1.2.3 酵母菌的鑒定 按照Makimura 等[20]的方法進行DNA 提取。按照Kurtzman 等[21]的方法進行核糖體26S D1/D2 區(qū)核苷酸序列擴增，所用引物為NL1 5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′和NL4 5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′。PCR 采用25 μL體系：10×PCR buffer（2.5 mmol/L，含Mg2+） 2.5 μL，NL1（10 μmol/L） 0.5 μL，NL4（10 μmol/L） 0.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μL，DNA 模板0.75 μL，Taq酶（5 U/μL） 0.25 μL，最后添加滅菌水18.5 μL。使用BIO-RAD S1000TM PCR 擴增儀進行PCR 反應。PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，51 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。電泳檢測、回收純化后的PCR 產(chǎn)物，交由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將所測菌株的26S D1/D2 區(qū)核苷酸序列提交GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），進行BLAST 分析，與相關(guān)序列進行同源性比較。選取與菌株親緣關(guān)系較近的菌株，應用Clustal X軟件進行序列多重比對[22]，利用MEGA5.1 軟件中鄰接法（Neighbor-joining，N-J） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)進化分析，校驗參數(shù)Bootstrap 重復1 000 次[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗酵母菌的篩選

在與蘋果炭疽病菌的對峙試驗中，PDA 平板上接種酵母菌株YG3 后雖無明顯的抑菌圈，但蘋果炭疽病菌菌絲稀疏，生長明顯弱于對照（圖1）。計算得出抑菌率為55.6%。

圖1 酵母菌與蘋果炭疽病菌的平板對峙Fig.1 Plate confrontation between yeast and C. gloeosporioides of apple

2.2 拮抗酵母菌序列分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

以酵母菌株YG3 純培養(yǎng)物總DNA 為模板，獲得大小為640 bp 的核糖體26S D1/D2 區(qū)核苷酸序列。將酵母菌株YG3 基因序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號（GenBank NO.MF045447）。Blast 搜索結(jié)果顯示，該片段與Cryptococcus spp.的同源性高達99%以上。采用Clustal X 軟件與親緣關(guān)系較近的酵母菌基因序列進行多重比對，應用MEGA 5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果（圖2） 顯示，酵母菌株YG3 與Cryptococcus flavescens（GenBank NO.AB035042）、Cryptococcus flavescens（GenBank NO.FJ743610）、Cryptococcus flavescens（GenBank NO.AM160631）、 Cryptococcus flavescens（GenBank NO.KF830175） 和Cryptococcus flavescens（GenBank NO.KM246005） 聚在同一分支上。據(jù)此，將酵母菌株YG3 鑒定為Cryptococcusflavescens。

圖2 基于26S rDNA D1/D2 區(qū)序列Neighbor-Joining 構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic tree drawn from Neighbor-Joining analysis of 26S rDNA D1/D2 domain sequence alignment

3 結(jié)論

拮抗 酵 母 菌 在 蘋 果[7，12～14]、橘[24]、桃[25，26]、葡 萄[27]、草莓[28，29]等果樹病害的生物防治中均有所應用，且取得了不同程度的抑菌效果。如，拮抗菌Metschnikowia pulcherrima 對芒果采后炭疽病菌有明顯的拮抗作用[15，30]；Cryptococcus laurentii 通過營養(yǎng)競爭（特別是對蔗糖的競爭）、空間競爭以及誘導寄主產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等有效抑制芒果炭疽病害[31]；Pichia membranaefaciens酵母單獨或與殼聚糖聯(lián)合能有效控制柑橘類水果炭疽病的發(fā)生[32]。本研究中，通過蘋果炭疽病菌平板對峙試驗，對從蘋果果實表面分離、純化得到的19 株酵母菌進行了篩選，發(fā)現(xiàn)酵母菌株YG3 可明顯抑制病原菌菌絲的生長，病原菌菌絲稀疏、生長弱，抑菌率為55.6%。經(jīng)過核糖體26S D1/D2 區(qū)核苷酸序列的比較，將酵母菌株YG3 鑒定為Cryptococcus flavescens（Gen－Bank NO.MF045447）。對于Cryptococcus flavescens 對蘋果炭疽病菌的抑菌機理還有待于進一步的研究。