馬卓奇 敖娜 都健

中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌代謝內(nèi)科，沈陽 110032

非酒精性脂肪性肝病( NAFLD) 是指患者在沒有大量攝入酒精、病毒感染或其他肝病的情況下，形成的慢性肝臟疾病，其病理類型包括單純脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎( NASH) 、肝纖維化和肝硬化［1］。NAFLD 是在全球引起肝臟疾病的重要原因之一，估計其患病率在全球為24%［2］。在一些西方國家，NAFLD 在普通人群中的患病率約為20%，NASH 的患病率約1.2% ～4.8%［3］。盡管NAFLD的預后相對較好，但仍有相當一部分患者會發(fā)展成為NASH和晚期肝硬化，且有可能進一步發(fā)展成為肝細胞癌。許多研究表明，線粒體功能障礙在NAFLD的發(fā)病中起重要作用，而近年來，越來越多的研究表明，microRNA( miRNA) 與肝臟疾病及線粒體功能障礙的發(fā)生關(guān)系密切，但其參與NAFLD發(fā)病的具體機制仍不明確。因此，闡明線粒體相關(guān)miRNA 對NAFLD 發(fā)生、發(fā)展的作用，對NAFLD的預防、早期診斷和治療具有重大意義。本文就線粒體相關(guān)miRNA參與NAFLD 發(fā)生、發(fā)展的機制進行概述，以期為NAFLD 發(fā)病機制的研究提供幫助。

1 線粒體相關(guān)miRNA概述

miRNA 是一種大小約19 ～25 個核苷酸的非編碼小RNA，可通過靶向mRNA，抑制其翻譯或促進其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達、細胞增殖、分化、代謝、凋亡等多種生物功能。miRNA中有一類與線粒體關(guān)系密切( 線粒體相關(guān)miRNA) ，是近年來發(fā)現(xiàn)的細胞代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，可影響線粒體功能，包括線粒體動力學、活性氧簇的產(chǎn)生、能量代謝和電子傳遞鏈等，在線粒體代謝、線粒體形態(tài)學、線粒體DNA 損傷和線粒體介導的凋亡中發(fā)揮重要作用［4］。

2 線粒體相關(guān)miRNA 與NAFLD

雖然NAFLD 的發(fā)病機制尚不明確，但“二次打擊”假說被較多人認可?！暗谝淮未驌簟卑ㄒ葝u素抵抗引起的肝臟脂肪堆積; “第二次打擊”為線粒體功能障礙、炎性細胞因子、脂質(zhì)過氧化和氧化應激的相互作用，導致肝細胞損傷、炎性反應和纖維化。近年來該假說已被“多重打擊”假說所取代?！岸嘀卮驌簟奔僬f中胰島素抵抗導致脂肪生成增加和攝取肝游離脂肪酸( FFAs) 增加，脂毒性使肝臟易于受到“多重打擊”損傷，包括線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、飲食因素、脂肪酸、鐵超載、炎性反應激活、腸道菌群脂多糖的產(chǎn)生、脂肪因子表達改變等，從而導致NAFLD［5］。

在NAFLD 患者中發(fā)現(xiàn)存在miRNA表達的改變，證實了miRNA參與NAFLD的發(fā)?。?］。另外，由于傳統(tǒng)的病理技術(shù)( 如組織活檢) 需要從病灶獲得組織，會對肝臟造成損傷，具有一定風險，而且所取的局部肝臟組織并不能反映肝臟及患者的整體情況，而miRNAs受細胞外囊泡( 如外泌體) 、miRNA結(jié)合蛋白( 如argonaute) 和高密度脂蛋白的保護，非常穩(wěn)定，在血漿中不會降解，因此其有可能成為非侵入性NAFLD的診斷標志物。

近年研究發(fā)現(xiàn)，線粒體在NAFLD的發(fā)病和進展中起重要作用，NASH患者和使用可致NASH藥物的患者中都存在線粒體異常［3］。肝線粒體通過調(diào)節(jié)β氧化、三羧酸循環(huán)、ATP 合成和釋放活性氧簇來協(xié)調(diào)能量代謝。線粒體是活性氧簇產(chǎn)生和脂肪酸β 氧化的主要部位，其功能受損將導致肝臟胰島素抵抗、脂肪變化及活性氧簇在NAFLD不同階段的增加［6］。線粒體活性氧簇生成的增加不但損傷線粒體DNA，而且可以導致大量細胞因子的表達增加以及誘導氧化應激［4，7-8］。此外，活性氧簇生成的增加通過抑制電子傳遞鏈，導致ATP 水平下降，從而影響肝細胞能量代謝和功能，甚至導致肝細胞死亡，這都與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［6］。因此，推測線粒體相關(guān)miRNA 可能通過影響線粒體功能，從而參與NAFLD。有研究發(fā)現(xiàn)，在NAFLD小鼠肝臟組織中線粒體相關(guān)miRNA發(fā)生顯著變化［9-10］。多個線粒體相關(guān)miRNA參與了肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展，在其中發(fā)揮不同功能。

3 線粒體相關(guān)miRNA 參與NAFLD 的機制

3．1 線粒體相關(guān)miRNA調(diào)控細胞因子 線粒體中活性氧簇生成增加導致大量細胞因子的表達增加，包括Fas 配體、腫瘤壞死因子( TNF) -α、轉(zhuǎn)化生長因子-β 和白細胞介素( IL) -8等，它們在調(diào)節(jié)機體炎性反應、胰島素抵抗、免疫和代謝等過程中起重要作用，且參與了NAFLD 的發(fā)?。?］。

Ji 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-141-3p 可以促進促炎細胞因子IL-6的表達，影響脂蛋白脂肪酶，誘導炎性反應，進一步在HepG2細胞和高脂飲食誘導的小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)，miRNA-141-3p通過靶向第10 號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白同源體，激活磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 通路，促進ATP 的產(chǎn)生，導致線粒體功能障礙。在動物模型上，miRNA-378也被證明可以通過直接結(jié)合腺苷-磷酸激活的蛋白激酶γ2調(diào)節(jié)亞基( PRKAG2) ，調(diào)控沉默信息調(diào)節(jié)因子( SIRT)1 活性和核因子-κB-TNF-α通路，產(chǎn)生大量促炎性細胞因子，進一步促進肝臟炎性反應和纖維化。另外，通過比較38 例NASH 患者肝臟樣本與24 名正常樣本發(fā)現(xiàn)，miRNA-378 表達在NASH 患者中存在差異［11］。

近年來有研究者認為腸-肝軸參與了NAFLD 的發(fā)病，腸-肝軸功能障礙( 細菌過度生長、腸道菌群失調(diào)、黏膜通透性改變) 可能促進細菌及其產(chǎn)物易位進入門靜脈循環(huán)，通過肝細胞Toll樣受體信號激活炎性反應，并從單純脂肪變性發(fā)展為NASH［12］。已有研究證實，miRNA-144的減少通過靶向Toll 樣受體2，促進TNF-α 和干擾素γ 的分泌，從而促進核因子κB介導的炎性反應，引起高脂飲食誘導的大鼠模型的NASH 病理進展。相反，過表達miRNA-146b可以直接抑制IL-1 受體相關(guān)激酶1 和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，從而改善大鼠的NASH 病理進展［13］。而在NAFLD 中TNF-α水平升高，通過抗TNF抗體治療小鼠，可以逆轉(zhuǎn)模型中作為ETC 酶的線粒體呼吸鏈( MRC) 復合物活性的損傷。這些研究都證明，線粒體相關(guān)miRNA可以通過調(diào)控細胞因子，引起線粒體功能障礙，參與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展。

3．2 線粒體相關(guān)miRNA 影響脂肪酸氧化 肝臟是脂肪酸氧化的重要部位，而線粒體是脂肪酸和葡萄糖氧化和代謝的主要細胞器，線粒體功能障礙可能導致脂質(zhì)積累增加。肝臟脂質(zhì)的積累是由血漿FFAs、脂肪從頭生成和膳食脂肪的攝入共同作用的結(jié)果，這種脂質(zhì)積累導致肝脂肪變性，其特征是在肝細胞中甘油三酯作為脂滴積累［6］。肝FFAs 通過線粒體β 氧化為肝臟提供能量，當脂肪酸氧化不能利用過多的FFAs 時，過量FFAs 被酯化成甘油三酯，導致肝臟脂肪變性［14-15］。此外，線粒體活性或表達異常引起的脂質(zhì)積累會增加脂質(zhì)毒性代謝物，進而引起肝損傷［14］。

已有研究在細胞層面證實，miRNA-29a-3p通過靶向過氧化物酶體增殖物活化受體( PPAR) δ，對葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4 啟動子進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，影響從脂肪酸氧化到糖酵解的代謝轉(zhuǎn)換［16］。在動物層面上，在NASH 動物模型中也可觀察到PPARδ表達下降，而miRNA-199 可通過靶向心臟和肝臟線粒體中的PPARδ，減少脂肪酸氧化，改變線粒體含量和增加心臟、肝細胞脂質(zhì)沉積［17］。此外，在NASH小鼠肝臟中PPARα表達降低，miRNA-21是NASH和肝細胞癌患者血清及肝中上調(diào)最多的miRNA之一，其以PPARα為靶點直接參與NASH 發(fā)病［22］。敲除miRNA-21可以誘導PPARα的表達，有助于實驗模型疾病的好轉(zhuǎn)，而在臨床研究中發(fā)現(xiàn)NAFLD患者肝臟、骨骼肌和血清中miRNA-21水平明顯升高，同時伴有PPARα的減少［18］。PPARα的激活增加了過氧化物酶體、線粒體β 氧化酶和解耦聯(lián)蛋白2 mRNA的表達，而解耦聯(lián)蛋白2 在肝臟組織中表達，與線粒體功能相關(guān)。因此可以推測，線粒體相關(guān)miRNA可通過調(diào)控PPAR來影響脂肪酸氧化，引起線粒體的功能障礙，參與NAFLD 的發(fā)病。

定位于線粒體的SIRT3 是一種線粒體組蛋白去乙?；?，是線粒體脂肪酸氧化的重要調(diào)控因子，其通過抑制活性氧簇在細胞過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-421 通過抑制SIRT3，進而影響SIRT3/FOXO3通路來誘導NAFLD小鼠肝臟線粒體功能障礙［9］。而miRNA-33則通過靶向SIRT6影響脂肪酸氧化，因此推測線粒體相關(guān)miRNA還可以通過調(diào)控SIRT，影響脂肪酸氧化，從而誘導NAFLD 的發(fā)生。

在動物模型上的研究表明，miRNA-378通過核呼吸因子1 調(diào)控脂肪酸氧化，提示miRNA-378可作為NAFLD的潛在治療靶點，而核呼吸因子1 是核編碼線粒體蛋白和線粒體生成的關(guān)鍵調(diào)控因子［15］。另外，在動物模型中敲除miRNA-378-3p會導致其線粒體脂肪酸代謝增強，胰島素靶組織氧化能力提高，證實miRNA-378-3p在線粒體呼吸中具有關(guān)鍵作用。

3．3 線粒體相關(guān)miRNA與氧化應激相關(guān) 在細胞層面上的實驗證明，miRNA-15b-5p通過抑制Bmpr1a信號通路，增強細胞凋亡、氧化應激和線粒體損傷［19］。另外，miRNA-98-5p 作為一種應激相關(guān)的miRNA，在多種細胞類型和疾病中對細胞的存活、凋亡和氧化應激起重要的調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在細胞中過表達的miRNA-98-5p可以抑制活性氧簇的產(chǎn)生，抑制miRNA-98-5p則出現(xiàn)了相反的現(xiàn)象［20］。而活性氧簇的產(chǎn)生可以誘導氧化應激。Elhanati等［21］也證明在肝細胞癌中miRNA-122對SIRT6進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，且共同調(diào)控脂肪酸β 氧化，miRNA-122作為肝臟中最豐富的miRNA，可以影響膽固醇和FFAs 代謝、丙肝病毒復制和肝細胞癌生長等過程。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NASH患者血清miRNA-122比健康人上調(diào)7．2 倍，比單純脂肪變性患者上調(diào)3．1 倍［22］。在人體組織及動物層面的研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-122與線粒體誘導的凋亡、調(diào)節(jié)脂代謝、炎性反應和肝臟氧化應激有關(guān)［23-24］。這些研究都表明，miRNA 可以通過氧化應激來參與NALFD 發(fā)病過程，而線粒體是氧化應激的主要場所，因此推測這些線粒體相關(guān)miRNA 可能通過線粒體來參與NALFD。

3．4 線粒體相關(guān)miRNA 調(diào)控線粒體復合物 有研究表明，NASH 患者肝臟中存在線粒體DNA 損傷，多個線粒體DNA 編碼的多肽蛋白表達降低，部分由線粒體DNA 編碼的復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ( ATP 合成酶) 活性降低，復合物Ⅱ( 僅由核DNA 編碼) 活性降低，而NASH患者中，這些復合物的活性比正常人降低30% ～50%［3］。而這些復合物活性下降導致活性氧簇的產(chǎn)生和ETC 活性降低，ETC 活性降低可進一步損傷線粒體呼吸功能。

Jagannathan 等［25］發(fā)現(xiàn)在ATP6 位點，miRNA-378靶向并結(jié)合線粒體轉(zhuǎn)錄組，而抑制ATP6( ATP 合酶F0 復合體的亞基) 會影響ATP 生成。另外，miRNA-181c也被證實可以靶向調(diào)控ETC 復合物Ⅳ和線粒體細胞色素C 氧化酶1 的線粒體基因組亞基［26］。miRNA-33a、miRNA-661、miRNA-4485 則 可以分別通過影響線粒體復合物Ⅰ亞單位NDUFA5、線粒體復合物Ⅲ、線粒體復合物Ⅰ的活性，引起線粒體功能障礙和肝損傷，因此推測線粒體相關(guān)miRNA可能通過調(diào)控線粒體復合物，引起線粒體功能障礙，從而參與NAFLD的發(fā)病過程。

3．5 其他特殊類型的miRNA mitomiRNA是一種可以在線粒體中定位的miRNA，一般能同時靶向調(diào)控多個線粒體相關(guān)基因的mRNA，影響三羧酸循環(huán)、脂代謝和氨基酸代謝等多種代謝途徑［27］。Bandiera等［28］在HeLa細胞的線粒體RNA 中發(fā)現(xiàn)了13 個含量豐富的核編碼mitomiRNA，通過對其中4 個靶點(miRNA-328、miRNA-494、miRNA-513和miRNA-638) 的分析發(fā)現(xiàn)，其均與線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)。mitomiRNA的線粒體定位受動態(tài)調(diào)控，應激事件的發(fā)生，如創(chuàng)傷性腦損傷，與mitomiRNA 的重新分布有關(guān)，表明mitomiRNA可能參與了線粒體功能的改變，并可能導致代謝性疾病患者出現(xiàn)線粒體功能障礙。

在NAFLD患者中，miRNA-34a隨著病情加重而上升，而SIRT1 的表達降低［22］。抑制miRNA-34a 則可以通過靶向SIRT1和激活PPARα，從而激活AMP活化蛋白激酶通路，改善肝脂肪變性，此外，其還可影響肝X 受體等轉(zhuǎn)錄因子，進而調(diào)節(jié)體內(nèi)能量平衡［1，29］。而miRNA-146則通過靶向肝臟線粒體載體蛋白，參與NASH 的發(fā)病，將miRNA-146b類似物靶向輸入NAFLD小鼠模型的肝細胞，可以有效緩解小鼠肝脂肪變性［30］。雖然已證實多個mitomiRNA參與NAFLD 的發(fā)病，但目前其與NAFLD發(fā)生相關(guān)的研究很少，具體機制尚不清楚。

4 總結(jié)與展望

近年來NAFLD的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重危害人類健康，但目前仍缺乏特效的治療措施。線粒體相關(guān)miRNA對線粒體功能有很大影響，而線粒體功能障礙在NAFLD發(fā)病機制中起重要作用。在組織、細胞、動物和分子多個維度的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體相關(guān)miRNA 對多條代謝通路有影響，對其進行調(diào)節(jié)可用于NAFLD的治療，雖然還未應用于臨床，但其有望成為NAFLD潛在的藥物靶點。另外，由于miRNA 在血液中的穩(wěn)定性，其有可能作為NAFLD診斷及預后的分子標志物?？傊U明線粒體相關(guān)miRNA參與NAFLD的作用機制，不但有助于對該病分子機制的研究，而且能為其診療和預防提供新的方法和思路。