丁心順；翟丹云；何海寧

（甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司，甘肅 蘭州 730020）

無角陶賽特羊和特克塞爾羊都具有四季發(fā)情、產(chǎn)羔率高、羔羊初生重較大、肉用性狀突出、耐粗飼及適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良的種質(zhì)特點(diǎn)。目前，在大力提倡發(fā)展舍飼養(yǎng)羊業(yè)的同時(shí)，也存在一些客觀的問題，如發(fā)展純粹的舍飼養(yǎng)羊業(yè)，缺乏優(yōu)良的肉羊品種和較低的繁殖效率；因此，通過建立經(jīng)濟(jì)雜交模式，引進(jìn)國外優(yōu)秀的肉羊種公羊（如無角陶賽特羊和特克塞爾羊）與我國地方綿羊品種交配，利用雜交優(yōu)勢[1]。通過現(xiàn)代分子育種技術(shù)結(jié)合經(jīng)典育種方法，提高選種的精準(zhǔn)度，加快遺傳育種進(jìn)展[2]。本試驗(yàn)以影響Invedal和Cambridge綿羊多胎性狀的BMP15基因作為多胎候選基因，利用PCRSSCP技術(shù)，對無角陶賽特羊和特克塞爾羊這2個(gè)綿羊品種的BMP15基因第1外顯子進(jìn)行多態(tài)性分析，旨在探索該候選基因與無角陶賽特羊、特克塞爾羊繁殖性能之間的關(guān)系，為開展無角陶賽特羊和特克塞爾羊高繁殖力的遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)，然后再進(jìn)行分子水平的研究并且將研究成果應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，從而為選育出具有優(yōu)秀繁殖性能和肉用性能特征的舍飼型綿羊提供理論依據(jù)，進(jìn)而加快肉用綿羊遺傳育種的發(fā)展進(jìn)程[3]。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動物

本試驗(yàn)以無角陶賽特母羊18只、特克塞爾母羊35只，共2個(gè)綿羊品種53個(gè)個(gè)體為研究對象。

1.2 試驗(yàn)器材

DNA提取試劑盒、ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、10×Buffer、DNA Marker (DL2000)、PCR產(chǎn)物純化試劑盒。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)動物血樣樣本的采集

頸靜脈采血10 ml，ACD 抗凝，生物冰袋用保溫盒低溫運(yùn)輸，-70℃保存?zhèn)溆?。樣本量總?jì)53只。無角陶賽特母羊18只，特克塞爾母羊35只。

2.2 全血基因組DNA提取

參照Saremi Mohammad Ali 等[4]方法，提取綿羊血液基因組DNA。

2.3 DNA檢測

① 稱取0.5g瓊脂糖，量取50 ml 1×TAE緩沖液轉(zhuǎn)入三角瓶中并混合均勻，加熱溶解至溶液呈現(xiàn)清亮狀態(tài)，然后加入2μL核酸染料，充分混勻待用。

② 把已經(jīng)溶好的瓊脂糖，晾至一會，使其溫度達(dá)到60℃左右，將瓊脂糖溶液倒入膠槽，插入合適的梳子，輕輕搖動，使凝膠液分布均勻。

③ 將瓊脂糖置于室溫中待其凝固，大約35～45 min，夏季氣溫高需要的時(shí)間稍長一些，待凝膠完全凝固后，把梳子輕輕拔掉，將凝膠輕輕放進(jìn)電泳槽中，在電泳槽內(nèi)加入 1×TAE緩沖液且要沒過凝膠。

④ 將1μL 6×buffer與4μL DNA樣品充分混合后加樣，然后開始電泳，電壓為90-150V電泳15～30 min。

⑤ 電泳工序結(jié)束后放在凝膠成像儀上，在紫外燈下觀察、拍照。

2.4 PCR擴(kuò)增

2.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 本試驗(yàn)根據(jù)GenBank已經(jīng)發(fā)布的綿羊BMP15基因的DNA序列(登錄號：NM-001114767)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5設(shè)計(jì)1對特異性引物，引物由大連寶生物公司合成。引物序列、PCR產(chǎn)物大小及所在的位置見表1。

表1 BMP15基因第1外顯子擴(kuò)增引物序列信息

2.4.2 PCR最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)程序（見2、表3）

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)程序

2.4.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測待測PCR產(chǎn)物上樣量為3.5 μL，凝膠濃度根據(jù)Marker要求而定，其余步驟參考2.3。

2.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）

（1）選擇濃度適宜的聚丙烯酰胺凝膠要根據(jù)引物擴(kuò)增片段的大小。（2）用蒸餾水清洗制膠用玻璃板和制膠架，烘干，裝備玻璃板。（3）在清洗干凈的錐形瓶內(nèi)加入濃度適宜的丙烯酰胺、5×TBE緩沖液、10%過硫酸銨、TEMED和超純水，混勻后緩慢倒入已裝備好的玻璃板之間，小心插入梳子，注意不要產(chǎn)生氣泡，觀察凝膠聚合情況，隨時(shí)補(bǔ)加混合液。（4）凝膠聚合后，輕輕拔掉梳子，用注射器針吸取TBE緩沖液，沖洗點(diǎn)樣孔，然后將玻璃板轉(zhuǎn)移到電泳槽上，用鐵夾子固定，在電泳槽中倒入1×TBE緩沖液。（5）250 V電壓下預(yù)電泳20 min。（6）取3 ul PCR產(chǎn)物，加入8 ul變性緩沖液（98 %甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.025%溴酚蘭、0.025%二甲苯青），瞬時(shí)離心，98℃變性10 min，立即置于冰水浴上，冰浴10 min后，全部點(diǎn)樣于上述的非變性聚丙烯酰胺凝膠中。（7）在4℃中，180 V的電壓下恒溫恒壓電泳14～20 h（具體情況見表5）。（8）電泳結(jié)束后，取出凝膠于瓷盤中，在凝膠上打孔做上標(biāo)記。（9）用超純水沖洗凝膠1次，在瓷盤中加入銀染固定液，輕搖8～10 min，再用超純水沖洗1遍。（10）加入銀染染色液，輕搖5 min，再用超純水沖洗2遍。（11）最后加入顯影液，輕搖30s～1min。（12）待條帶清晰后，倒出顯影液，用超純水沖洗2遍。（13）用保鮮膜將膠包裹好置于用紫外凝膠成像儀觀察成像，分析基因型，拍照保存。

表4、5為各引物的SSCP分析條件。

表4 中性凝膠聚丙烯酰胺凝膠的組成

表5 中性凝膠聚丙烯酰胺凝膠濃度及電泳條件

2.6 PCR產(chǎn)物的純化和回收與測序

隨機(jī)挑選出3個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用PCR產(chǎn)物的純化試劑盒進(jìn)行純化，送交生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用BioEdit和MEGA5.0分析擴(kuò)增序列；利用PopGene32對樣本各擴(kuò)增片段的遺傳信息進(jìn)行分析。

4 結(jié)果

4.1 基因組DNA的提取及檢測結(jié)果

本試驗(yàn)使用DNA提取試劑盒提取綿羊血液基因組DNA。所得基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。由圖可知，各泳道條帶清晰整齊，無拖尾現(xiàn)象，表明DNA提取良好，可直接用于后續(xù)試驗(yàn)。

4.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

隨機(jī)選取5份樣，利用設(shè)計(jì)好的特異性引物擴(kuò)增BMP15基因第1外顯子，2%的瓊脂糖凝膠檢測，得到大小為307 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，且條帶清晰、無雜帶（見圖2：1～5泳道），特異性良好，可以直接進(jìn)行后續(xù)的SSCP分析。

圖1 DNA檢測結(jié)果

圖2 BMP15基因第1外顯子PCR擴(kuò)增結(jié)果

4.3 SSCP檢測結(jié)果

對不同個(gè)體的PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果見圖3，BMP15基因第1外顯子沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，均為AA型。

圖3 BMP15基因第1外顯子SSCP檢測結(jié)果

4.4 測序結(jié)果

隨機(jī)選擇3個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收后送交生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示（如圖4），測序峰圖清楚規(guī)整，結(jié)果可靠。在編碼區(qū)第28～30位點(diǎn)沒有發(fā)生堿基CTT的缺失，不存在多態(tài)性。

圖4 BMP15基因第1外顯子測序結(jié)果

5 分析與討論

國內(nèi)外對BMP15基因多態(tài)性的研究比較多，但主要集中在FecX、FecXH、FecXB和FecXG基因上，對BMP15基因第1外顯子突變的研究比較少[5]。楊燕燕等[6]對蒙古羊以及小尾寒羊BMP15基因第1外顯子的突變位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，該突變位點(diǎn)在蒙古羊和小尾寒羊中均存在三種基因型，即野生型、突變雜合型以及突變純和型，并且經(jīng)過分析生產(chǎn)數(shù)據(jù)可知，BMP15基因第1外顯子的突變不是影響小尾寒羊多態(tài)性狀的候選基因，該結(jié)果同以前的研究結(jié)果一致，但結(jié)果提示該突變有可能是影響蒙古羊雙羔群體繁殖性能的主效基因或與控制蒙古羊雙羔性狀的主效基因有著密切的關(guān)系。目前，對于影響無角陶賽特羊和特克塞爾羊雙羔性能主效基因的相關(guān)研究和報(bào)道還很少。本試驗(yàn)利用PCR-SSCP方法，對無角陶賽特羊和特克塞爾羊這2個(gè)綿羊品種的BMP15基因第1外顯子進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明：在2個(gè)綿羊品種中均沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，測序結(jié)果也表示，在編碼區(qū)第28～30位點(diǎn)，沒有發(fā)生堿基CTT的缺失，這與楊燕燕等[6]的研究結(jié)果有差異，可能是由于樣本量較小，未能檢測出突變個(gè)體，因此，還需要大量的研究來進(jìn)一步確定BMP15基因多態(tài)性與綿羊繁殖性能的相關(guān)性。無角陶賽特羊和特克塞爾羊作為我國地方引進(jìn)的國外優(yōu)良肉羊品種，有必要對其種質(zhì)特性進(jìn)行深入研究，并在分子水平對其遺傳規(guī)律和機(jī)制進(jìn)行闡述，將對今后我國綿羊品種資源保護(hù)及生產(chǎn)利用具有特殊而重要的意義。

6 小結(jié)

利用PCR-SSCP技術(shù)對無角陶賽特羊和特克塞爾羊這2個(gè)綿羊品種的BMP15基因第1外顯子進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明：BMP15基因第1外顯子在這2個(gè)綿羊品種中不存在多態(tài)性。