倪夢(mèng)霞，王瑋，鄭愛燕，丁潔，邢麗賢，劉敏娟，毛君，蒲艷，鄒琴燕，孟慶霞，李紅，偶健*，張癸榮*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心，蘇州 215002；2. 北京市中科遺傳與生殖醫(yī)學(xué)研究院，北京 100026)

脊髓性肌萎縮癥(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是一種以脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化變性為特征的常染色體隱性遺傳病，常見的臨床特征為對(duì)稱性、進(jìn)行性的肢體近端和軀干肌肉無力、萎縮和癱瘓[1-2]，其發(fā)病率約為1/6 000～1/10 000[3]，具有典型的臨床異質(zhì)性。目前，國際上根據(jù)SMA的臨床表現(xiàn)，共將其分為4種亞型。Ⅰ型(Werdnig-Hoffman病)即嚴(yán)重型，出生6個(gè)月之內(nèi)發(fā)病，患者不能坐立，通常2歲前死亡。Ⅱ型即中間型，出生6～18個(gè)月內(nèi)發(fā)病，患者可以坐但無法站立亦無獨(dú)立行走能力，伴有關(guān)節(jié)攣縮和脊柱后突，壽命超過2歲，具體存活年齡通常視呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥而定。Ⅲ型(Kugelburg-Welander 病)，出生18個(gè)月后發(fā)病，患者可獨(dú)立行走，但行走無力，伴有脊柱側(cè)突和骨質(zhì)疏松，可存活至成年。Ⅳ型即成年型，發(fā)病年齡為15～60歲，35歲是高發(fā)年齡，患者可能出現(xiàn)行走困難，無消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)癥狀，存活時(shí)間與正常人無異[2，4]。除這幾種類型外，還有一種不常見的類型，稱為 SMA 0 型，這種類型發(fā)生在宮內(nèi)，表現(xiàn)為明顯的胎動(dòng)減少，若不及時(shí)采取措施，可于1歲內(nèi)死亡。SMA患者主要的致病基因是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活(SMN)基因，該基因編碼的蛋白是一種跨物種蛋白，生物信息學(xué)研究顯示該蛋白高度保守，且在身體各部位均有表達(dá)，其在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)量最高[5-8]。

本研究收集了1個(gè)SMA家系的臨床資料，采用Real-time PCR法檢測SMN1基因exon7 拷貝數(shù)，結(jié)合二代測序(NGS)及單體型連鎖分析為該家系提供遺傳咨詢，并為攜帶者夫婦進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)。

資料和方法

一、研究對(duì)象

2013年3月一對(duì)表型正常夫婦攜帶先證者于蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心進(jìn)行遺傳咨詢。經(jīng)體格檢查，發(fā)現(xiàn)先證者可以坐但無法站立亦無法正常行走，同時(shí)伴有關(guān)節(jié)攣縮及脊柱后突，被確診為SMA患者。經(jīng)家系調(diào)查后，明確該夫婦生育過3次，其中1例為先證者，1例已死亡，另生育1健康女孩夭折。2014年至2016年另妊娠3次，于孕中期在本院行產(chǎn)前診斷均為SMA患兒，均引產(chǎn)(圖1)。2017年該夫婦要求行PGD再生育，簽署知情同意后在本院進(jìn)行PGD。

圖1 家系圖

二、研究方法

1.SMN1基因檢測：收集先證者及其父母的EDTA-K2抗凝外周血樣本，采用TIANGEN試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA。針對(duì)SMN1基因exon7設(shè)計(jì)特異性引物，引物 5′端分別用FAM和 HEX熒光基團(tuán)標(biāo)記，上游引物序列為：5′-CCTTTTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3′；下游引物序列為：5′-GATTGTTTTACATTAACCTTTCAACTTTT-3′。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。隨后采用常州百代生物科技有限公司的Super MultiProbe Kit試劑盒進(jìn)行Real-time PCR，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.PGD策略：SMA PGD可使用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒(Sureplex，BlueGenome，英國)進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(WGA)。利用該家系建立單體型，采取家系中收集的外周血樣本證實(shí)Sureplex WGA試劑盒可以有效擴(kuò)增目標(biāo)單核苷酸多態(tài)(SNP)位點(diǎn)和致病變異所在位置，證實(shí)全基因組擴(kuò)增成功。這一家系將在通過單體型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后進(jìn)入PGD程序。可先對(duì)所有胚胎進(jìn)行單體型連鎖分析和Sanger測序，不攜帶致病變異的胚胎再進(jìn)行染色體拷貝數(shù)分析。

3.PGD流程：根據(jù)南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心制定的常規(guī)促排卵方案，取卵后進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)人工授精。培養(yǎng)5～6 d后，將形成的4枚囊胚，按本中心常規(guī)操作流程行胚胎活檢，取5～8個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增[9]。

4.單體型連鎖分析：以SMN1基因(28 Kb)的exon7的70247773位點(diǎn)為目標(biāo)區(qū)域，并在該基因的上游3M區(qū)域內(nèi)選擇51個(gè)及下游2M區(qū)域選擇56個(gè)高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳標(biāo)記，利用ION AMPLISEQTM DESIGNER網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物，經(jīng)DNA純化、建庫和NGS后，選擇若干有效位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析。

5.全基因組低覆蓋度測序：取120 ng Sureplex全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)其進(jìn)行酶切打斷，后經(jīng)連接、純化、文庫擴(kuò)增和低覆蓋度測序(0.03X)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)24條染色體進(jìn)行拷貝數(shù)分析。

結(jié) 果

一、SMN1基因檢測結(jié)果

先證者及其父母于蘇州市立醫(yī)院進(jìn)行抽血檢測，Real-time PCR法檢測發(fā)現(xiàn)先證者父母的SMN1基因7號(hào)外顯子為單拷貝，而先證者(患兒1)為SMN1基因的7號(hào)外顯子純合缺失；胎兒1為行PGD后植入胚胎發(fā)育的胎兒，拷貝數(shù)正常；胎兒2～4為自然妊娠行產(chǎn)前診斷的羊水樣本，均為SMN1基因的7號(hào)外顯子純合缺失；胎兒5為生育的正常女孩，拷貝數(shù)正常(圖2)。

圖2 SMN1基因檢測結(jié)果

二、單體型連鎖分析結(jié)果

確定家系的致病原因后，以基因SMN1的exon7為目標(biāo)區(qū)域，在該基因及基因的上下游選擇高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳標(biāo)記，NGS后選擇若干有效位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析。

三、NGS PGD結(jié)果

通過單體型連鎖分析之后進(jìn)行單基因病PGD周期，形成4枚囊胚(胚胎1～4)，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)：未攜帶突變的整倍體囊胚1枚，單拷貝攜帶的整倍體囊胚1枚，單拷貝攜帶但為非整倍體囊胚1枚，致病的整倍體囊胚1枚(表1，表2)。將未致病的整倍體囊胚行FET后獲得臨床妊娠，產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示未見異常，足月剖宮產(chǎn)分娩一正常男嬰，體重3 150 g，健康狀況良好。

表1胚胎單體型連鎖分析

表2 胚胎NGS PGD檢測結(jié)果

討 論

SMA于 1891 年由 Guido Werdnig 首次報(bào)告[9-10]，是一種以脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化變性為特征的常染色體隱性遺傳病。根據(jù)其臨床表現(xiàn)共分為4種亞型。目前，SMA的診斷方法主要包括血清肌酶譜檢測、SMA病理特點(diǎn)、神經(jīng)電生理特征、分子生物學(xué)檢測[2]等。其中，SMA患者的血清肌酶譜檢測能夠與多數(shù)的肌源性疾病相區(qū)別，但這不能作為診斷SMA的唯一依據(jù)；而神經(jīng)電生理檢查雖然不是SMA的特異性指標(biāo)，卻作為一個(gè)重要的診斷指標(biāo)，可以提高SMA患者基因診斷的陽性率；另外，肌肉活檢是一種有創(chuàng)性檢查，許多患者及家屬對(duì)這種方法較為排斥，且不同亞型的SMA患者具有不同的病理特點(diǎn)，這就使得臨床診斷困難[11-13]。因此，分子生物學(xué)檢測對(duì)于疑似SMA的患者，尤其是Ⅰ、Ⅱ型患者，可依據(jù)患者的典型臨床表現(xiàn)，將基因檢測作為首選的診斷方法。對(duì)于臨床表現(xiàn)不典型(尤其是Ⅳ型患者)，可將神經(jīng)電生理和肌肉病理檢查作為診斷的可靠依據(jù)，再結(jié)合基因診斷做進(jìn)一步確診。

SMA的致病基因即SMN基因，大小約38 000 bp，編碼294個(gè)氨基酸，由這些氨基酸組成的蛋白高度保守，全身各部位均有表達(dá)，在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的表達(dá)量最高[14-15]。該基因定位于5號(hào)染色體，由于所在的染色體區(qū)域內(nèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且存在著重復(fù)序列和眾多假基因簇，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，極易發(fā)生基因的缺失、轉(zhuǎn)換[16-18]。SMN基因有2個(gè)高同源性拷貝，一個(gè)是位于端粒側(cè)的決定性基因SMN1基因；一個(gè)是位于著絲粒側(cè)的修飾性基因SMN2基因。2個(gè)高同源性拷貝僅有 5 個(gè)堿基的差異，其中2個(gè)堿基分別位于7和8號(hào)外顯子。SMA患者患病的主要原因是SMN1基因缺失，所占比例約為95%[19-20]。因此本中心采用Real-time PCR法檢測SMN1基因，當(dāng)發(fā)現(xiàn)這對(duì)夫婦的SMN1基因exon7均為單拷貝，而先證者為SMN1基因exon7純合缺失時(shí)基本可以明確其患病原因，進(jìn)而考慮采取PGD干預(yù)措施。

PGD技術(shù)是一種通過對(duì)體外受精形成的胚胎進(jìn)行遺傳物質(zhì)分析，以診斷胚胎是否存在遺傳異常，最終選擇無遺傳異常的胚胎植入宮腔，進(jìn)而可以獲得正常胎兒的診斷方法。PGD技術(shù)作為一種輔助生殖手段，有著明顯的優(yōu)勢，比如能夠有效地降低早期的流產(chǎn)率、新生兒缺陷的發(fā)生率以及胎兒的畸形率，可以使更多的家庭生育出健康的寶寶[21-22]。家族里已經(jīng)生育過出生缺陷患兒的夫婦大多渴望優(yōu)生優(yōu)育，PGD技術(shù)可以從一定程度上滿足這些夫婦的需求。但是，PGD技術(shù)也面臨一些問題，比如操作繁瑣，價(jià)格昂貴，且需要對(duì)胚胎進(jìn)行侵入性操作以獲得最終診斷。如何降低有創(chuàng)操作對(duì)胚胎造成的損傷還需要進(jìn)一步探索，同時(shí)大樣本的長期隨訪觀察對(duì)子代的影響也是有必要的。

在本病例中先證者及其弟弟即為SMN1基因7號(hào)外顯子純和缺失突變致病，其父母均為雜合缺失。進(jìn)行產(chǎn)前診斷選擇終止妊娠3例患病胎兒。該夫婦為避免再次妊娠患病胎兒的風(fēng)險(xiǎn)，選擇進(jìn)行PGD，最終剖宮分娩一正常男嬰。先證者由于7號(hào)外顯子純合缺失，使其無法表達(dá)有功能的全長SMN蛋白，從而對(duì)機(jī)體造成影響。由此可見，對(duì)于攜帶者的基因檢測在遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷中尤為重要。

目前，基于基因檢測的特異性和無創(chuàng)性以及SMN相關(guān)基因位點(diǎn)精確的靶向分子描述，分子生物學(xué)檢測逐漸成為確診SMA的金標(biāo)準(zhǔn)。迄今為止，SMA作為一種遺傳性神經(jīng)肌肉疾病尚未有完善的治療手段和預(yù)防方法?？梢詫?duì)計(jì)劃懷孕的夫婦進(jìn)行篩查，倘若夫妻雙方都是攜帶者，可建議在孕中期通過羊水穿刺提取胎兒DNA，進(jìn)行SMN基因檢測，以明確胎兒是否為患者；也可選擇通過PGD來生育一個(gè)健康的胎兒?；驒z測可以為SMA家系提供遺傳咨詢及婚育指導(dǎo)，可進(jìn)行有效的產(chǎn)前診斷，以減少患兒的出生。