喬 蕊,徐澤恒,孟新玲,夏 歡,楊新玲*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,烏魯木齊 830063;2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院腦病一科;3新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二常見(jiàn)且和年齡密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。全球有數(shù)百萬(wàn)人患病,60歲以上的人大約有1%的人受到該病的影響[1]。其中散發(fā)型帕金森病(sporadic Parkinson’s disease,SPD)占絕大多數(shù),約占90%左右。近年來(lái)在PD患者腦組織活檢中發(fā)現(xiàn)了活化的小膠質(zhì)細(xì)胞、人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)表達(dá)上調(diào)及炎性物質(zhì)的增高等,均提示免疫炎癥機(jī)制參與了PD的發(fā)病過(guò)程[2-5]。相關(guān)研究報(bào)道PARK18基因rs3129882是SPD的風(fēng)險(xiǎn)基因,其所在的HLA Ⅱ區(qū)單核苷酸多態(tài)性(single nuclear polymorphism,SNP)高度可變,存在民族及地區(qū)的差異[6-10]。rs3129882是PARK18基因的1號(hào)內(nèi)含子,參與基因的表達(dá)調(diào)控,并且相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)rs3129882作為順式元件參與PARK18基因剪接,影響PARK18基因編碼的蛋白形成及其抗原呈遞從而參與帕金森病的發(fā)生[11]。免疫球蛋白的合成受遺傳基因的調(diào)控,故基因的多態(tài)性可能影響免疫球蛋白的生成。故本課題組將研究PARK18基因rs3129882位點(diǎn)多態(tài)性與新疆地區(qū)SPD發(fā)病及免疫球蛋白水平的相關(guān)性。

1 對(duì)象及方法

1.1 研究對(duì)象

選取就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、第二附屬醫(yī)院及附屬中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診及病房符合帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)[12,13]的SPD患者193例,其中漢族SPD患者112例,維吾爾族SPD患者81例,男性SPD患者100例,女性SPD患者93例,平均年齡為(59.82±5.27)歲。同時(shí)選取體檢中心進(jìn)行體檢的健康體檢者232例作為對(duì)照組,其中漢族128例,維吾爾族104例,男性121例,女性111例,平均年齡為(59.69±5.12)歲。對(duì)照組與病例組在年齡、性別、民族方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn):①排除發(fā)熱和血常規(guī)異常的感染者;②排除患有免疫系統(tǒng)疾病者;③排除近1個(gè)月內(nèi)使用抗生素、激素和(或)應(yīng)用非甾體類(lèi)抗炎藥及免疫抑制劑者;④排除近期外傷及手術(shù)的患者;⑤排除肝腎功能異常者、嚴(yán)重心臟疾病者及在3個(gè)月內(nèi)接受過(guò)疫苗注射者;⑥排除惡性腫瘤或患有變性疾病者。

1.2 方法

1.2.1 DNA的制備及引物的設(shè)計(jì)、合成 抽取2 ml外周靜脈血置于抗凝管中,使用北京天根生化科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒,按照試劑盒配套說(shuō)明操作書(shū)提取基因組DNA。在紫外線分光光度計(jì)上,以稀釋DNA的緩沖液為對(duì)照測(cè)定基因組DNA在260 nm和280 nm處的吸光度(A)值,A260/A280為1.7-1.9,判為DNA純度合格。樣本-20 ℃保存,備用。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[14]由上海生工公司合成。PARK18基因rs3129882位點(diǎn):上游引物:5′-GAAGCAGGGGGACTATGACG-3′。下游引物:5′-TTATGTAGCCCTGCTGTGGT-3′。

1.2.2 目的基因PCR及測(cè)序 反應(yīng)體系共30 μl：10×PCR Buffer(Mg2+plus)3 μl,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3 μl,上下游引物(5 μmol/L)各1.5 μl,TaKaRa TaqTMPolymerase(5 U/ml)0.3 μl,DNA模板1 μl,加水補(bǔ)至30 μl。整個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Verity 96well PCR儀(美國(guó)ABI公司)中進(jìn)行。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;15個(gè)循環(huán)×(95 ℃ 30 s,65-50 ℃(-1 ℃/循環(huán))30 s,72 ℃ 60 s);20個(gè)循環(huán)×(95 ℃ 30 s,退火溫度52 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s);4 ℃保存,PCR產(chǎn)物為232 bp。所得PCR產(chǎn)物加樣10 μl于2%瓊脂糖凝膠中,以120 V電泳40 min,于紫外線凝膠成像儀下觀察,確定所得產(chǎn)物為研究所需片段。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物公司直接測(cè)序以確定DNA序列。PARK18基因rs3129882位點(diǎn)分析結(jié)果與既往國(guó)內(nèi)外相同研究一致,SPD組及對(duì)照組均存在AA、AG、GG三種基因型。

1.2.3 血清免疫球蛋白的檢測(cè) 取清晨空腹靜脈血2 ml置于真空促凝管,2 h內(nèi),4 ℃、4 000 r/min,離心5 min,取血清。使用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特特種蛋白分析儀采用免疫比濁法檢測(cè)血清中IgG、IgA、IgM水平,機(jī)器型號(hào):IMMAGE800,試劑盒:美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特免疫球蛋白G檢測(cè)試劑盒、免疫球蛋白A檢測(cè)試劑盒、免疫球蛋白M檢測(cè)試劑盒。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗(yàn)

病例組(P=0.358)和對(duì)照組(P=0.564)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05),表示兩組均有良好的群體代表性。

2.2 部分測(cè)序峰圖

病例組和對(duì)照組rs3129882位點(diǎn)測(cè)序均發(fā)現(xiàn)存在AA型(野生型)、AG型(雜合突變型)、GG型(純合突變型)三種基因型(見(jiàn)圖1)。

2.3 兩組rs3129882基因型和等位基因分布的比較

病例組與對(duì)照組PARK18基因rs3129882基因型和等位基因分布的比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表1)。

圖1 rs3129882位點(diǎn)測(cè)序圖Figure 1 Sequencing of rs3129882 site

表1SPD組與對(duì)照組rs3129882基因型和等位基因頻率分布比較例(%)

Table1Comparisonofrs3129882genotypeandallelefrequenciesindifferentgroupscases(%)

組別n基因型頻率GGAGAAχ2P等位基因頻率GAχ2P病例組19377(39.9)85(44.0)31(16.1)0.1280.938239(61.9)147(38.1)0.0450.832對(duì)照組23289(38.4)106(45.7)37(15.9)284(61.2)180(38.8)

2.4 不同分層rs3129882基因型頻率及等位基因比較

按民族分層分析,維吾爾族SPD病例組和對(duì)照組rs3129882基因型頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.942,P=0.624),等位基因分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.017,P=0.895);漢族SPD病例組和對(duì)照組rs3129882基因型頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.242,P=0.886),等位基因分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.027,P=0.870)。按性別分層分析,男性SPD病例組和對(duì)照組rs3129882基因型頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.269,P=0.874),等位基因分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.158,P=0.691);女性SPD病例組和對(duì)照組rs3129882基因型頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.590,P=0.745),等位基因分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.118,P=0.146)。

2.5 三種基因型間IgG、IgA、IgM比較

對(duì)于SPD病例組,三種基因型間IgG(F=0.533,P=0.588)、IgA(F=1.299,P=0.275)、IgM(F=0.799,P=0.451)含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)于對(duì)照組,三種基因型間IgG(F=0.341,P=0.712)、IgA(F=0.449,P=0.639)、IgM(F=0.727,P=0.484)含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 不同分層三種基因型間IgG、IgA、IgM比較

按民族分層分析,對(duì)于SPD病例組,漢族和維吾爾族三種基因型間IgG、IgA、IgM含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表2);對(duì)于對(duì)照組,漢族和維吾爾族三種基因間IgG、IgA、IgM含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表2)。

分組民族基因型nIgGIgAIgM病例組漢族GG4410.55±1.602.49±0.760.79±0.18AG5110.45±1.742.71±0.690.80±0.17AA1711.00±0.962.40±0.780.83±0.20F0.7671.6020.329P0.4670.2060.720維吾爾族GG3311.69±0.962.59±0.531.24±0.62AG3411.87±0.942.41±0.481.11±0.43AA1411.73±1.202.33±0.251.25±0.60F0.2961.9840.590P0.7450.1440.557對(duì)照組漢族GG51 9.78±1.502.63±0.850.91±0.45AG55 9.53±2.092.59±0.780.99±0.56AA22 9.86±1.492.76±0.901.02±0.46F0.3980.3110.499P0.6730.7330.608維吾爾族GG3810.72±1.801.89±0.741.35±0.77AG5110.52±1.481.79±0.791.44±0.61AA1510.08±1.901.70±0.681.30±0.71F0.7930.4070.321P0.4550.6670.726

按性別分層分析,對(duì)于SPD病例組,男性和女性三種基因間IgG、IgA、IgM含量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表3);對(duì)于對(duì)照組,男性和女性三種基因型間IgG、IgA、IgM含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表3)。

分組性別基因型nIgGIgAIgM病例組男GG4011.14±1.292.46±0.570.91±0.39AG4611.15±1.712.58±0.660.95±0.34AA1411.06±0.932.42±0.590.97±0.39F0.0220.6180.185P0.9790.5410.831女GG3710.94±1.662.62±0.771.06±0.56AG3910.87±1.522.59±0.600.89±0.34AA1711.56±1.232.33±0.621.06±0.53F1.2861.1251.563P0.2820.3290.215對(duì)照組男GG4710.15±1.822.35±0.880.99±0.50AG5410.21±1.942.25±0.931.22±0.60AA2010.03±1.692.43±1.091.10±0.50F0.0710.3152.099P0.9310.7300.127女GG4210.22±1.56 2.28±0.891.22±0.76AG529.79±1.812.16±0.821.20±0.66AA179.85±1.642.20±0.811.18±0.68F0.7990.2180.021P0.4530.8040.979

3 討論

PD最早是在1817年由Parkinson醫(yī)生提出的,臨床上主要以靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)弛緩的典型運(yùn)動(dòng)癥狀為主。盡管從PD第一次被提出到現(xiàn)在已200余年,但目前該病的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確,除此之外疾病的診斷及治療也十分有限。因此亟需加深對(duì)疾病的研究,明確病因、機(jī)制,找到有效的診斷及治療方法。免疫機(jī)制和PD的關(guān)系是由Abramsky等[15]首先提出的,近年來(lái)越來(lái)越多的研究成果也證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)。探討PARK18基因rs3129882位點(diǎn)多態(tài)性與新疆SPD及免疫球蛋白的關(guān)系,這對(duì)SPD的早期診斷、治療具有重要的臨床價(jià)值。

3.1 兩組研究對(duì)象PARK18基因rs3129882位點(diǎn)多態(tài)性比較

在最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS)中PARK18基因被定義為散發(fā)型帕金森病的風(fēng)險(xiǎn)基因[14]。rs3129882被認(rèn)為是與PD相關(guān)性最強(qiáng)的非編碼多態(tài)性位點(diǎn),其通過(guò)免疫機(jī)制增加了SPD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。PARK18基因rs3129882位點(diǎn)多態(tài)性與SPD的關(guān)系最早是在白種人中發(fā)現(xiàn)的[14],在該項(xiàng)研究中作者發(fā)現(xiàn)rs3129882(A/G)的G等位基因與美國(guó)人患帕金森病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān),并強(qiáng)調(diào)了該位點(diǎn)與帕金森病及人類(lèi)免疫的關(guān)系。Jamshidi等[16]研究發(fā)現(xiàn)rs3129882的等位基因頻率在伊朗帕金森病患者和對(duì)照組之間存在顯著的差異,從而推測(cè)出rs3129882的多態(tài)性可能是伊朗人PD的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素。田錦勇[17]通過(guò)對(duì)中國(guó)漢族SPD患者及對(duì)照組的PARK16-18基因位點(diǎn)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)rs3129882位點(diǎn)所有基因型中,SPD組A等位基因頻率高于對(duì)照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,另外對(duì)該位點(diǎn)基因型按年齡和性別進(jìn)行分層分析時(shí)發(fā)現(xiàn)AA基因型多見(jiàn)于男性,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但Ma等[18]在包括中國(guó)、新加坡和馬來(lái)西亞在內(nèi)的帕金森病病例對(duì)照研究的薈萃分析中發(fā)現(xiàn)rs3129882等位基因型分布在病例組與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異,從而推測(cè)出PARK18基因rs3129882 A/G多態(tài)性和中國(guó)帕金森病患者無(wú)關(guān),這和本文研究結(jié)果一致。近年來(lái)有關(guān)PARK18基因rs3129882位點(diǎn)多態(tài)性與SPD關(guān)系的研究逐年增加,但結(jié)果不盡相同,可能與PARK18基因rs3129882是一組免疫應(yīng)答基因,具有高度多態(tài)性,存在民族及地區(qū)差異有關(guān)。此外SPD的發(fā)生不是單一因素的作用而是包括基因-環(huán)境因素在內(nèi)多種因素共同作用的結(jié)果。本文研究結(jié)果暫不能證明PARK18基因rs3129882位點(diǎn)多態(tài)性與新疆地區(qū)SPD患者發(fā)病相關(guān),除了上述提到的兩種因素外,還可能與樣本量相對(duì)不足有關(guān),但不能就此排除該基因多態(tài)性參與SPD發(fā)病可能。因此PARK18基因rs3129882位點(diǎn)多態(tài)性在不同地區(qū)、不同人群中是否為SPD發(fā)病的危險(xiǎn)因素還需深入研究。

3.2 PARK18基因rs3129882位點(diǎn)多態(tài)性和免疫球蛋白之間的關(guān)系

不同的抗原分子的特殊表位被不同的HLA Ⅱ類(lèi)基因產(chǎn)物識(shí)別,進(jìn)而刺激機(jī)體產(chǎn)生不同免疫應(yīng)答。HLA特殊類(lèi)型的存在可能使機(jī)體對(duì)某些抗原產(chǎn)生高免疫球蛋白[19,20]。免疫球蛋白的合成受遺傳基因的控制,故PARK18基因rs3129882位點(diǎn)多態(tài)性可能使機(jī)體對(duì)某些抗原產(chǎn)生過(guò)高的免疫球蛋白。謝慶玲等[21]通過(guò)分析HLA基因多態(tài)性與支氣管哮喘兒童IgE水平關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1*160XX和HLA-DRB1*3(17)等位基因與哮喘兒童的血清IgE水平相關(guān),且HLA-DRB1*160XX可能是高水平血清IgE的抗性基因。季偉等[22]研究發(fā)現(xiàn)毛細(xì)支氣管炎患兒外周血淋巴細(xì)胞HLA-DR表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組,并與血清IgE水平呈顯著的正相關(guān)。于立杰等[23]研究發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1*03基因與IgG4相關(guān)疾病易感有關(guān)。除此之外,其他疾病如浸潤(rùn)型肺結(jié)核、Graves眼病、慢性蕁麻疹等研究證實(shí)了HLA Ⅱ類(lèi)基因多態(tài)性與免疫球蛋白之間有一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果表明SPD患者PARK18基因rs3129882位點(diǎn)多態(tài)性和IgG、IgA、IgM水平無(wú)關(guān),但因目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)研究涉及PARK18基因rs3129882位點(diǎn)多態(tài)性與免疫球蛋白之間的關(guān)系,故需反復(fù)研究明確兩者之間的關(guān)系。