郭 芳,黃 碩,劉 寧,朱 勇,劉昌奎

(西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科學(xué)教研室,西安 710021;*通訊作者,E-mail:guofang@xiyi.edu.cn)

2003年世界口腔健康統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占口腔惡性腫瘤的90%以上,OSCC的發(fā)病率在26種主要惡性癌癥中位居第8位[1],以手術(shù)為主的綜合治療為目前的一般治療原則,但術(shù)后易導(dǎo)致語言、進(jìn)食、吞咽等各種口腔功能障礙及顏面部畸形均嚴(yán)重威脅著人類的生活質(zhì)量和健康[2]?；蛑委煂?duì)于癌細(xì)胞具有潛在的靶向性,miRNA是一種長(zhǎng)度為21-25個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA,能夠識(shí)別特定的目標(biāo)mRNA的3′端UTR的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn),并與之結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)控[3]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與癌癥的發(fā)生和發(fā)展是密切相關(guān)的[3]。

miR-195在多種實(shí)體腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)處于低表達(dá)狀態(tài),如結(jié)腸癌[4]、胃癌[5]、肝癌[6]等。但是,miR-195在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其相關(guān)作用機(jī)制如何呢?本研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-195的靶基因,構(gòu)建pcDNATM6.2-GW-pre-miR-195重組表達(dá)質(zhì)粒,通過雙熒光素酶報(bào)告基因預(yù)測(cè)miR-195對(duì)下游靶基因RAF1表達(dá)的影響,以及對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)功能的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑

口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-4細(xì)胞株、pcDNATM6.2-GW、E.coli DH5α、pmirGLO真核載體均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)中心提供。限制性內(nèi)切酶(Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、SacⅠ和XhoⅠ)、T4DNA連接酶、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit)均購自Takara公司(大連)，質(zhì)粒抽提、凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、RNA抽提試劑Trizol購自美國(guó)Vitrogen公司，RIPA、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，PVDF膜、蛋白發(fā)光液購自Millipore公司，鼠抗人β-actin購自Santa Cruz公司，RAF1購自Abcam公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自Promega公司。

1.2 miR-195過表達(dá)載體的構(gòu)建與si-RAF1的設(shè)計(jì)合成

從miRBase網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中檢索has-miR-195的pre-miR-195頸環(huán)序列,設(shè)計(jì)并合成兩端帶有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)雙鏈DNA，序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,正義鏈為5′-AATTCAGCTTCCCTGGCTCTAGCAGCACAGAAATAT TGGCACAGGGAAGCGAGTCTGCCAATATTGGCTGTG CTGCTCCAGGCAGGGTGGTGA-3′,反義鏈為5′-AGCTTCACCACCCTGCCTGGAGCAGCACAGCCAATA TTGGCAGACTCGCTTCCCTGTGCCAATATTTCTGTGC TGCTAGAGCCAGGGAAGCTG-3′。將其退火為雙鏈DNA序列,采用T4 DNA連接酶將其與pcDNATM6.2大片段相連構(gòu)建為pre-miR-915過表達(dá)載體。si-RAF1兩條鏈分別為:5′-CUCACAGAUCCUUCUAAGATT-3′,5′-UCUUAGAAGGAUCUGUGAGTT-3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miR-195、RAF1的表達(dá)量

驗(yàn)證miR-195、si-RAF1在細(xì)胞株中的表達(dá),將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW-pre-miR-195及si-RAF1轉(zhuǎn)染SCC-4細(xì)胞,然后qRT-PCR檢查成熟miR-195的表達(dá)水平及RAF1被沉默后的表達(dá)水平。RAF1的上游引物為:5′-GGGAGCTTGGAAGACGATCAG-3′,下游引物為:5′-ACACGGATAGTGTTGCTTGTC-3′;miR-195的逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATA CGACGCCAATA-3′,上游引物為:5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′,下游引物為:5′-TGCTTAGCAGCACAGAAA-3′,U6和β-actin分別作為miR-195和RAF1的內(nèi)參。條件：95℃ 1 min預(yù)變性，95 ℃變性10 s，60 ℃退火，延伸40 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-195、RAF1的表達(dá)量。

1.4 MTT檢測(cè)SCC-4細(xì)胞增殖活性

96孔板每孔約3 000個(gè)細(xì)胞,采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,分別于轉(zhuǎn)染后24,48,72 h加入20 μl MTT,37 ℃孵育4 h棄上清，加入150 μl DMSO，于492 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)SCC-4細(xì)胞的吸光值。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SCC-4細(xì)胞形成能力

根據(jù)不同分組對(duì)SCC-4細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,24 h時(shí)分別按照500個(gè)/孔、1 000個(gè)/孔、2 000個(gè)/孔加入6孔板中。置于5% CO2,37 ℃培養(yǎng)。每隔2 d更換培養(yǎng)基。10-14 d觀察克隆形成的大小,棄去培養(yǎng)基,用PBS輕輕沖洗3次、風(fēng)干。每孔加入0.1%的結(jié)晶紫500 μl,37 ℃,染色30 min,再用PBS沖洗干凈。用凝膠成像儀拍照。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SCC-4細(xì)胞凋亡

按2×105個(gè)/孔將細(xì)胞種于12孔板中。24 h觀察細(xì)胞狀態(tài)生長(zhǎng)良好,融合度達(dá)到80%以上,更新培養(yǎng)液1 ml,轉(zhuǎn)染si-RAF1和si-control至SCC-4細(xì)胞。待細(xì)胞培養(yǎng)48 h,胰酶消化細(xì)胞收集于15 ml離心管中,1 000 r/mim離心5 min。吸取棄上清,PBS沖洗細(xì)胞3次。棄上清,加400 μl的1×binding buffer,重懸細(xì)胞,再加5 μl Annexin Ⅴ-FITC,于4 ℃避光染色15 min。加入10 μl PI染液,避光4 ℃染色5 min,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SCC-4細(xì)胞周期

根據(jù)不同分組對(duì)SCC-4細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將收集的SCC-4細(xì)胞，加入含70%乙醇的PBS(4 ℃預(yù)冷2 h以上)重懸細(xì)胞，4 ℃過夜固定。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用PBS沖洗細(xì)胞2次，離心棄上清PBS，避光加150 μl RNA酶和150 μl PI，輕柔混合，室溫避光靜置30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-195對(duì)RAF1的靶向作用

采用targetscan(http://www.targetscan.org/)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則選取miR-195的候選靶基因RAF1，分別于TGTTTTCAGAGAAGCTGCTGCTA及其互補(bǔ)鏈兩側(cè)添加SacⅠ和XhoⅠ雙酶切位點(diǎn)，命名為野生型RAF1(WT-RAF1)，同時(shí)在種子區(qū)設(shè)計(jì)突變型RAF1(MT-RAF1)，并將其退火為雙鏈DNA，與pmirGLO載體大片段相連構(gòu)建為RAF1野生型及突變型報(bào)告載體。收集對(duì)數(shù)期的SCC-4細(xì)胞，每孔約4×103個(gè)細(xì)胞鋪于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別轉(zhuǎn)染miR-195+pmirGLO，miR-195+WT-RAF1，miR-195+MT-RAF1。根據(jù)Promega公司雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書添加螢火蟲和海腎熒光素酶試劑進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAF1的遷移能力

將轉(zhuǎn)染的SCC-4細(xì)胞5×105/ml置于含1% FBS的DMEM的Transwell上室內(nèi),下室加入含10% FBS的600 μl DMEM,孵育24 h,棉簽擦去上室細(xì)胞,倒置風(fēng)干Transwell小室,24孔板中加入500 μl結(jié)晶紫,小室浸于其中,37 ℃孵育30 min，PBS清洗、拍照。

1.10 Western blot檢測(cè)RAF1表達(dá)

將轉(zhuǎn)染后的SCC-4細(xì)胞采用RIPA裂解液按照操作說明提取蛋白，配置10%的SDS-PAGE凝膠，每孔20 μg蛋白量上樣、電泳，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫下孵育1.5 h，TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光觀察蛋白的表達(dá)情況。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建miR-195過表達(dá)載體及si-RAF1

將構(gòu)建成功的miR-195過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SCC-4細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)顯示,轉(zhuǎn)染miR-195組的細(xì)胞中miR-195的表達(dá)顯著高于miR-control組(見圖1);同時(shí),將合成的si-RAF1轉(zhuǎn)染SCC-4細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染si-RAF1組細(xì)胞中的RAF1的表達(dá)顯著低于si-control組(P<0.01,見圖1),上述結(jié)果提示miR-195的過表達(dá)載體及si-RAF1均成功合成并且在SCC-4細(xì)胞中均具有良好的轉(zhuǎn)染效率。

與相應(yīng)對(duì)照組相比,**P<0.01圖1 miR-195和si-RAF1在OSCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證Figure 1 Verification of transfection efficiency of miR-195 and si-RAF1 in oral squamous cell carcinoma

2.2 miR-195、si-RAF1抑制SCC-4細(xì)胞的生長(zhǎng)

分別將miR-195過表達(dá)載體、si-RAF1及相應(yīng)control轉(zhuǎn)染SCC-4細(xì)胞,MTT法、細(xì)胞克隆及流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-195及si-RAF1對(duì)OSCC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。與對(duì)照組相比,miR-195過表達(dá)能夠顯著抑制SCC-4細(xì)胞的增殖活性、克隆形成能力及誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生阻滯(P<0.05，見圖2),同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染si-RAF1的SCC-4細(xì)胞,其增殖活性、克隆形成能力也要明顯低于si-control組,并且顯著誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生阻滯(P<0.05,見圖2),上述結(jié)果提示miR-195過表達(dá)與RAF1的表達(dá)下調(diào)對(duì)SCC-4細(xì)胞均可發(fā)揮抑癌效應(yīng),抑制OSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.3 miR-195與si-RAF1能夠促進(jìn)SCC-4細(xì)胞凋亡

miR-195與si-RAF1分別轉(zhuǎn)染SCC-4細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明,與對(duì)照組相比,miR-195的過表達(dá)及RAF1的表達(dá)下調(diào)均可促進(jìn)SCC-4細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的發(fā)生(P<0.05,見圖3),從而提示miR-195與si-RAF1具有促進(jìn)OSCC凋亡發(fā)生的效應(yīng)。

2.4 miR-195和si-RAF1能夠降低SCC-4細(xì)胞的遷移能力

將miR-195過表達(dá)載體及si-RAF1轉(zhuǎn)染SCC-4細(xì)胞后采用Transwell實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力。如圖4所示,與miR-control組相比,miR-195過表達(dá)組細(xì)胞的遷移率明顯降低;同樣,與si-control組相比,si-RAF1組細(xì)胞的遷移率也明顯降低,提示miR-195過表達(dá)及RAF1的表達(dá)下調(diào)均可抑制OSCC細(xì)胞的遷移能力。

A.細(xì)胞增殖活性檢測(cè) B.克隆形成能力 C.細(xì)胞周期分布變化與對(duì)照組相比,*P<0.05，**P<0.01圖2 miR-195與si-RAF1異常表達(dá)對(duì)SCC-4細(xì)胞增殖活性、克隆形成能力及細(xì)胞周期的調(diào)控Figure 2 Effect of abnormal expression of miR-195 and si-RAF1 on proliferation activity, clone formation ability and cell cycle of SCC-4 cells

與相應(yīng)對(duì)照組相比,*P<0.05，**P<0.01圖3 miR-195與si-RAF1對(duì)SCC-4細(xì)胞凋亡的調(diào)控Figure 3 Regulation of miR-195 and SI-RAF1 to apoptosis of SCC-4 cells by flow cytometry

2.5 miR-195能夠靶向下調(diào)RAF1的表達(dá)

分別對(duì)SCC-4細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-195+WT-RAF1、miR-195+MT-RAF1,采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,miR-195過表達(dá)能夠顯著抑制WT-RAF1報(bào)告載體的熒光活性(P<0.05),而miR-195過表達(dá)對(duì)MT-RAF1的熒光活性無顯著抑制效應(yīng)(見圖5A)。此外,qRT-PCR檢測(cè)顯示,miR-195過表達(dá)能夠顯著抑制RAF1的mRNA的表達(dá)(P<0.01,見圖5B)。Western blot檢測(cè)顯示miR-195過表達(dá)能夠顯著抑制RAF1蛋白的表達(dá)(見圖5C)。由此提示miR-195在OSCC細(xì)胞中與RAF1之間存在良好的靶向關(guān)系,能夠靶向下調(diào)RAF1的表達(dá)。

3 討論

目前有研究顯示miR-195的異常表達(dá)能夠參與人類惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展,但是在不同腫瘤中miR-195的表達(dá)卻存在差異,同時(shí)miR-195可能涉及的相關(guān)信號(hào)通路也不盡相同。在膀胱癌中,miR-195的表達(dá)顯著降低,其通過抑制膀胱癌細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換而抑制膀胱癌生長(zhǎng)[7],提示其在膀胱癌中扮演著抑癌的角色。同樣,Li等[8]學(xué)者也在宮頸癌中發(fā)現(xiàn)miR-195的表達(dá)顯著降低,并且可以通過靶向細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的侵襲和致瘤性。此外,在結(jié)腸癌中也發(fā)現(xiàn)了miR-195的表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào),過表達(dá)的miR-195與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示miR-195過表達(dá)組的SCC-4細(xì)胞增殖活性顯著低于空載體組;凋亡率高于空載體組;G1期的細(xì)胞百分比顯著增高,S/G2期顯著降低;細(xì)胞遷移率明顯降低。結(jié)果表明miR-195能夠抑制SCC-4細(xì)胞的增殖,促進(jìn)SCC-4細(xì)胞的凋亡,誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S的阻滯,降低SCC-4細(xì)胞的遷移。

圖4 miR-195與si-RAF1對(duì)OSCC細(xì)胞遷移能力的調(diào)控Figure 4 Regulation of miR-195 and si-RAF1 to migration ability of OSCC cells by Transwell

與control比較,*P<0.05 與miR-control比較，**P<0.01 A.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果 B. qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果 C. Western blot檢測(cè)結(jié)果圖5 miR-195與RAF1靶向關(guān)系的研究Figure 5 Study on the relationship between miR-195 and RAF1

RAF1為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,是Ras/Raf/MEK/Erk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的成員。RAF1與多種細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞和上皮細(xì)胞的增殖、存活和遷移密切相關(guān)[10]。在上皮細(xì)胞中,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維生長(zhǎng)因子受體活化的信號(hào)傳導(dǎo)都通過下游的RAF1,其可被看作是幾種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)腫瘤血管生成的信號(hào)樞紐[11];阻斷RAF1可能同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的生存和血管形成[12],因此RAF1很有希望成為腫瘤靶向治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。如在Hood等[11]的試驗(yàn)和Culmsee等[13]的試驗(yàn)都是以RAF1為靶點(diǎn),阻斷了RAF1信號(hào)傳導(dǎo),從而抑制腫瘤及腫瘤血管生成。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)RAF1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中顯著增高,原因與miR-7-5p的表達(dá)降低相關(guān),miR-7-5p作為腫瘤抑制基因通過靶向RAF1癌基因來調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染si-RAF1的SCC-4細(xì)胞的增殖活性明顯低于空載體組;凋亡率高于空載體組;G1期的細(xì)胞百分比顯著增高,S/G2期顯著降低;細(xì)胞遷移率明顯降低。沉默RAF1能夠抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-4細(xì)胞的增殖,促進(jìn)SCC-4細(xì)胞的凋亡,誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S的阻滯,降低口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-4細(xì)胞的遷移,其作用結(jié)果與過表達(dá)miR-195相一致,那么二者之間是否存在相互的調(diào)控關(guān)系呢?

生物信息學(xué)軟件是預(yù)測(cè)miRNAs靶基因重要方法之一。本研究通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)miR-195可能作用的靶基因,結(jié)果顯示,miR-195與RAF1之間存在良好的堿基互補(bǔ)關(guān)系,提示RAF1可能是miR-195的候選靶基因。為了驗(yàn)證該假說,本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示miR-195過表達(dá)能明顯抑制野生型RAF1報(bào)告載體的熒光活性,同時(shí)結(jié)合Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-195過表達(dá)能夠顯著抑制RAF1的mRNA和蛋白的表達(dá),從而進(jìn)一步證實(shí)了本研究的假說:miR-195與RAF1之間存在良好的靶向關(guān)系。

綜上所述,在OSCC中,miR-195的過表達(dá)及RAF1的表達(dá)下調(diào)可以顯著抑制SCC-4細(xì)胞的增殖活性,促進(jìn)SCC-4細(xì)胞的凋亡,誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S的阻滯,降低SCC-4細(xì)胞的遷移能力;同時(shí)可以靶向下調(diào)RAF1的mRNA和蛋白表達(dá)。因此,miR-195可能通過靶向RAF1引起OSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移能力,并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,可作為OSCC細(xì)胞靶向治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn),這也為課題后期進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。