張 帆,賈 昕,姚 紅,逯曉青,郭 超,楊曉峰

(1山西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科;*通訊作者,E-mail:yxfylq@163.com)

乳腺癌(breast cancer)是全世界女性最常見的惡性腫瘤,其病死率居于女性腫瘤之首。我國(guó)乳腺癌患者死亡率高于國(guó)外患者,但治愈率較低,嚴(yán)重威脅著女性的生命健康,近年來乳腺癌靶向藥物顯著提高了患者治療效果[1]。目前迫切需要研發(fā)新的診斷和治療手段以提高乳腺癌患者的治愈率和降低死亡率。而尋找無(wú)創(chuàng)、敏感性高、特異性強(qiáng)且簡(jiǎn)單可行的腫瘤標(biāo)志物作為乳腺癌的早期診斷和治療工具將具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

噬菌體展示技術(shù)是一種將多肽或蛋白展示在噬菌體衣殼蛋白表面,并能將所需的多肽或蛋白從含有大量變異體的集落中分離出來的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。十幾年來,國(guó)內(nèi)外的研究人員利用噬菌體展示技術(shù)針對(duì)不同的腫瘤進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)了多種腫瘤靶向肽,這些靶向肽對(duì)腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境例如腫瘤血管有親和力[2]。這些特異性多肽既可以作為體內(nèi)腫瘤成像劑,用于腫瘤及其微轉(zhuǎn)移灶的早期診斷;也可用于連接抗癌藥物進(jìn)行靶向治療,而不損傷其他健康組織。Bcap-37細(xì)胞屬于浸潤(rùn)性乳腺髓樣癌細(xì)胞,通過國(guó)內(nèi)外獻(xiàn)檢索尚未發(fā)現(xiàn)利用噬菌體展示技術(shù)篩選人Bcap-37細(xì)胞靶向肽的研究,本研究利用噬菌體展示技術(shù)篩選人乳腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合小肽,為乳腺癌早期診斷的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人乳腺髓樣癌Bcap-37細(xì)胞、人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A購(gòu)自上海奧陸生物科技有限公司。噬菌體展示七肽庫(kù)試劑盒(Ph.D.TM-7 Phage Display Peptide Library Kit)購(gòu)自New English Biolabs(NEB)公司。M13噬菌體單鏈基因組DNA快速提取試劑盒(M13 Isolation Kit)購(gòu)自美國(guó)Biomiga公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗M13單克隆抗體(HRP/Anti-M13)購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司。IPTG、Xgal、PEG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 噬菌體展示七肽庫(kù)體外減性篩選

將人乳腺髓樣癌Bcap-37細(xì)胞及人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。將兩種細(xì)胞懸液置于經(jīng)過多聚賴氨酸處理的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,在人乳腺癌Bcap-37細(xì)胞加入1%牛血清白蛋白(BSA)BSA 37 ℃孵育1 h時(shí)，加入Ph.D.TM- 7原始噬菌體展示七肽庫(kù)原液(滴度為2×1011pfu/ml)，37 ℃孵育1 h，用0.05% TBST洗滌5次去除未與細(xì)胞結(jié)合的噬菌體，加入0.2 mol/L甘氨酸洗脫液1 ml，將結(jié)合噬菌體洗脫下來。將洗脫液加入到已經(jīng)封閉好的人正常乳腺上皮MCF-10細(xì)胞培養(yǎng)皿中,室溫下作用1 h,上清液即為第一輪篩選得到的噬菌體,PEG法提純,進(jìn)入下一輪篩選。噬菌體展示肽庫(kù)體外減性篩選條件,肽庫(kù)與人乳腺癌Bcap-37細(xì)胞結(jié)合時(shí)間分別減少到45 min(第2輪)、30 min(第3輪)和20 min(第4輪);洗脫液與人正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞吸附時(shí)間增加到75 min(第2輪)、90 min(第3輪)和105 min(第4輪);把第4輪篩選所得的噬菌體液接種LB/IPTG/Xgal瓊脂平板,隨機(jī)挑選藍(lán)色陽(yáng)性噬菌體克隆大量擴(kuò)增提純。

1.3 單克隆噬菌體與Bcap-37細(xì)胞結(jié)合的特異性鑒定

從LB/IPTG/Xgal瓊脂平板隨機(jī)挑取的20個(gè)單克隆噬菌體進(jìn)行特異性檢測(cè),將人乳腺癌Bcap-37細(xì)胞及正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞以2×104/孔的密度鋪于96孔板,PBS做空白對(duì)照(每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔)。PBS沖洗細(xì)胞,加入50 μl 0.25%戊二醛溶液固定細(xì)胞15 min。加入100 μl 3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用5% PBS-BSA 37 ℃封閉60 min。每孔分別加入1×1010pfu單克隆噬菌體，37 ℃孵育1.5 h。PBS沖洗5次，加入HRP/Anti-M13抗體(100 μl/孔)，37 ℃作用1 h，加入TMB顯色液，待液體變藍(lán)后,全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值。將人乳腺癌Bcap-37細(xì)胞OD值設(shè)為S、正常乳腺上皮MCF-10細(xì)胞OD值設(shè)為P,采用公式為:S/P(S及P值均是相應(yīng)的OD值減去PBS空白對(duì)照的OD值之后的值),若比值大于2.5即為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4 陽(yáng)性單克隆噬菌體單鏈DNA測(cè)定及分析

將陽(yáng)性噬菌體克隆用M13噬菌體單鏈DNA提取試劑盒提取核酸，使用噬菌體肽庫(kù)試劑盒自帶-96gⅢ測(cè)序引物：5′-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′,由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序。登陸NCBI-BLAST網(wǎng)站對(duì)篩選的多肽序列與目前數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合噬菌體多肽的富集

以人乳腺髓樣癌Bcap-37細(xì)胞為靶細(xì)胞,人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A為吸附細(xì)胞,使用噬菌體展示隨機(jī)七肽庫(kù),進(jìn)行4輪減性篩選。結(jié)果顯示,噬菌體滴度由第1輪的4.0×104增加到第4輪的3.2×107(見圖1);同時(shí)回收得率也由第1輪的2.0×10-7增加至第4輪的1.6×10-4,提高了約800倍(見表1)。表明與人乳腺癌Bcap-37細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體逐漸增加,到第4輪出現(xiàn)明顯富集。

A. 第1輪篩選后噬菌體滴度測(cè)定 B. 第4輪篩選后噬菌體滴度測(cè)定圖1 噬菌體滴度測(cè)定Figure 1 Phage titer determination

表1噬菌體展示肽庫(kù)體外篩選后噬菌體克隆富集

Table1EnrichmentofphageclonesfromPhageDisplayPeptidesLibrarybyinvitroscreening

篩選輪數(shù)投入噬菌體量(pfu)回收噬菌體量(pfu)回收率12×10114.0×1042.0×10-722×10111.8×1069.0×10-632×10111.4×1077.0×10-542×10113.2×1071.6×10-4

回收率=洗脫回收的噬菌體量/投入的噬菌體量

2.2 乳腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合噬菌體克隆的鑒定

隨機(jī)挑取20個(gè)單克隆噬菌體藍(lán)斑,利用ELISA法鑒定單克隆噬菌體對(duì)人乳腺癌Bcap-37細(xì)胞的親和力。結(jié)果顯示,1,3,5,6,8,12,14,16,17,18和20號(hào)噬菌體Bcap-37細(xì)胞的OD450 nm值顯著高于MCF-10A細(xì)胞,S/P比值大于2.5,為陽(yáng)性噬菌體克隆(見圖2)。

圖2 ELISA檢測(cè)單克隆噬菌體親和力Figure 2 The affinity of monoclone phage by ELISA

2.3 乳腺癌細(xì)胞陽(yáng)性噬菌體DNA的測(cè)序及同源性分析結(jié)果

挑取20個(gè)陽(yáng)性的噬菌體克隆進(jìn)行DNA提取并測(cè)序(見圖3),得到外源性七肽插入的堿基序列,并翻譯出對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。結(jié)果顯示,重復(fù)率最高的噬菌體克隆的多肽序列為L(zhǎng)XRNTNX(13/20),其次為SAGFRIX(5/20)及LPPMNSX(2/20);LXRNTNX即為本研究篩選所得的七肽序列。氨基酸序列的同源性分析結(jié)果顯示,該序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因和蛋白無(wú)同源性,且國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均未見報(bào)道。

圖3 陽(yáng)性單克隆噬菌體基因測(cè)序圖Figure 3 Gene sequencing map of positive monoclonal phage

3 討論

1985年Smith等[3]成功創(chuàng)立了噬菌體展示技術(shù),1990年Scott等[4]在噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展并構(gòu)建了噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)。通過肽庫(kù)技術(shù)篩選的多肽分子具有較好的靶向特異性,因而成為目前癌癥診療中最具有潛力的方法之一。研究表明針對(duì)黑色素瘤、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌及鱗狀細(xì)胞癌等特定腫瘤有特異親和力的肽已被篩選出[5,6]。

噬菌體展示技術(shù)體外生物淘選(也常稱全細(xì)胞淘選)用于分離與細(xì)胞特定靶點(diǎn)連接的多肽,也就是將培養(yǎng)的完整細(xì)胞作為誘餌以達(dá)到分離各種細(xì)胞連接多肽的淘選方法。Liu等[7]利用噬菌體展示體外差減篩選方法,得到人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的靶向12肽序列GYSASRSTIPGK。Bcap-37細(xì)胞屬于浸潤(rùn)性乳腺髓樣癌細(xì)胞,是一種特殊的組織學(xué)類型,一般分化較低,預(yù)后不佳[8]。但根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)目前尚無(wú)篩選Bcap-37細(xì)胞靶向肽的報(bào)道。

本研究使用全細(xì)胞體外差減篩選方法對(duì)噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)與乳腺癌Bcap-37細(xì)胞進(jìn)行了4輪篩選。隨著篩選次數(shù)獲得的噬菌體量逐漸提高,回收率也逐輪遞增,說明與乳腺癌Bcap-37細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體得到了富集。隨機(jī)的選取20個(gè)生長(zhǎng)良好的單克隆噬菌體斑,通過ELISA法鑒定其親和力。經(jīng)對(duì)陽(yáng)性單克隆噬菌體進(jìn)行序列測(cè)定,得到的短肽LXRNTNX。本實(shí)驗(yàn)成功篩選獲得了人乳腺髓樣癌Bcap-37細(xì)胞的靶向多肽分子,在今后的研究中將通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證短肽LXRNTNX對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的特異性及親和力。本研究結(jié)果為乳腺癌早期診斷和靶向治療提供了可能的潛在靶點(diǎn)。