張 引,劉 陽(yáng),何靜春,劉亮亮,劉 斌,趙希洋*

(1武警特色醫(yī)學(xué)中心ICU,天津 300162;2天津市第四中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:Lvcaoyiyi1985@163.com)

百草枯是使用較為廣泛的快速觸殺型除草劑之一[1,2],可致人畜中毒,其中毒機(jī)制目前尚不十分明確,因此缺少特異性的解毒劑,中毒病人的死亡率為85%-95%[3,4]。百草枯中毒的早期重癥病人一般死于臟器功能衰竭[5,6],而晚期病人則會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的低氧血癥,大部分病人死于重度肺纖維化或者其綜合征,肺間質(zhì)纖維化與許多炎性因子及氧化應(yīng)激具有直接的關(guān)系[7,8]。由于肺組織存在多胺攝取體系,能夠主動(dòng)攝取百草枯,因此百草枯對(duì)肺組織的損害最為嚴(yán)重,早期百草枯中毒病人多為急性肺損傷,而后期病人則會(huì)引發(fā)不可逆轉(zhuǎn)的廣泛的肺纖維化[9]。以往研究肺腺癌腫瘤標(biāo)志物時(shí)發(fā)現(xiàn),涎液化糖鏈抗原-6(krebs von den lungen-6,KL-6)黏糖蛋白水平能夠快速直接反映肺泡上皮和間質(zhì)的損傷程度,其機(jī)制可能是KL-6黏糖蛋白能夠增強(qiáng)成纖維細(xì)胞增殖,因此對(duì)肺纖維化的發(fā)生以及發(fā)展產(chǎn)生一定程度影響[10,11]。研究表明KL-6黏糖蛋白與肺纖維化關(guān)系密切[12],大鼠腹腔注射百草枯可引發(fā)肺纖維化,該病理過程與人類百草枯中毒時(shí)肺纖維化的病理過程類似。故本實(shí)驗(yàn)采用百草枯制作大鼠肺纖維化模型,觀察大鼠肺組織變化及測(cè)定肺組織羥脯胺酸(hydroxyproline,HYP)、探討KL-6糖蛋白在百草枯中毒致急性肺損傷及纖維化組織的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠54只,體質(zhì)量250-280 g(購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心、生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK-(軍)2007-004)。百草枯購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。KL-6黏糖蛋白抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,羥脯氨酸含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,硫代巴比妥酸法MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,硫代巴比妥酸法SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 建模、分組及提取標(biāo)本

將54只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,使用隨機(jī)數(shù)字法分為百草枯模型組(n=27)和對(duì)照組(n=27)。百草枯模型組以0.4%百草枯稀釋溶液按照14 mg/kg的劑量行腹腔注射[13],對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水,分別于給藥后第7,14,28天處死前(每組9只大鼠)測(cè)量體質(zhì)量,觀察大鼠精神狀態(tài);摘除大鼠左肺;置-80 ℃凍存，測(cè)定大鼠的肺組織HYP含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。

1.3 肺泡炎癥、肺纖維化程度判斷

大鼠肺組織石蠟切片HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。根據(jù)Szapiel等[15]的方法評(píng)價(jià)肺組織病理改變:無(wú)肺泡炎癥或者無(wú)纖維化、且肺組織的受累面積為0時(shí),標(biāo)記為“-”;輕度肺泡炎癥或者纖維化、而且肺組織的受累面積<20%時(shí),標(biāo)記為“+”;中度肺泡炎癥或者纖維化、而且肺組織的受累面積為20%-50%時(shí),標(biāo)記為“++”;重度肺泡炎癥或者纖維化、而且肺組織的受累面積>50%時(shí),標(biāo)記為“+++”。

1.4 肺系數(shù)測(cè)定

大鼠建模成功后,在第7,14,28天時(shí)將大鼠頸錐脫臼處死、開胸取肺,用濾紙將肺表面的血水吸取干凈,用電子天平稱重,計(jì)算肺系數(shù),肺系數(shù)=(大鼠的濕肺質(zhì)量÷大鼠體質(zhì)量)×100。

1.5 酸水解法測(cè)定肺組織HYP含量

大鼠肺組織研磨均漿,加6 mol/L氯化鉀溶液1 ml,130 ℃水解5 h，調(diào)節(jié)pH值6.5-7.0,加雙蒸水30 ml和0.05 mol/L的氯胺1.0 ml搖勻,室溫反應(yīng)20 min,用ELISA法檢測(cè)HYP含量,按照HYP含量測(cè)定試劑盒說明書操作,取分光光度計(jì)在550 nm處測(cè)量吸光度值,計(jì)算羥HYP含量。

1.6 肺組織MDA含量和SOD活性測(cè)定

大鼠的肺組織研磨勻漿,4 000 r/min離心10 min,提取上清液2 ml,加0.6%TBA溶液2 ml,沸水浴15 min。利用硫代巴比妥酸法,按照MDA檢測(cè)試劑盒和SOD檢測(cè)試劑盒說明書操作,取上清液在532 nm和450 nm的波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。

1.7 肺組織KL-6黏糖蛋白含量測(cè)定

造模后第7天、第14天和第28天,通過尾靜脈采集外周血3 ml,置3.2%枸櫞酸鈉抗凝管,4 ℃保存,用ELISA測(cè)定KL-6定量,按照試劑盒說明書操作,使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光值,計(jì)算KL-6濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量及精神狀態(tài)

在三個(gè)不同時(shí)點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠體質(zhì)量增加、精神狀況較好;而百草枯模型組大鼠的體質(zhì)量先下降,在第28天時(shí)開始回升,但與同期對(duì)照組比較體質(zhì)量仍較輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。百草枯組大鼠給藥第7天時(shí),精神萎靡、精神不振、進(jìn)食變少、活動(dòng)量降低、呼吸急促、口鼻有血性分泌物,第28天時(shí)精神轉(zhuǎn)好、活動(dòng)量和體質(zhì)量增加。

2.2 兩組大鼠染毒后的肺組織水腫情況

百草枯模型組大鼠中毒第7天時(shí),大鼠的肺組織出現(xiàn)水腫,肺泡間隔開始變寬,肺泡腔內(nèi)有滲出,肺毛細(xì)管擴(kuò)張充血,可見中性粒細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn);中毒后第14天,肺組織的充血情況減少,部分肺葉少量瘀血,肺部腫脹變輕,肺內(nèi)的炎性細(xì)胞集中,膠原纖維增多;中毒后第28天時(shí),肺泡結(jié)構(gòu)變寬、塌陷,炎性浸潤(rùn)減輕,膠原纖維以及纖維細(xì)胞出現(xiàn)(見圖2)。

圖1 實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠體質(zhì)量變化Figure 1 Changes of body mass of rats in two groups at different time points

圖2 兩組大鼠染毒后的肺組織水腫情況 (免疫組化SP法,×400) Figure 2 Pulmonary edema after exposure in two groups (immunohistochemical SP method,×400)

2.3 兩組大鼠染毒后的肺系數(shù)變化

百草枯模型組大鼠隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng),其肺系數(shù)明顯增加,在第14天時(shí)達(dá)到最大值,之后其肺系數(shù)開始降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3),提示百草枯組大鼠在中毒后第14天時(shí)肺水腫。

2.4 肺組織HYP含量

百草枯模型組大鼠隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),肺組織HYP含量增多,與同期對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

2.5 肺組織SOD活性及MDA含量

百草枯組大鼠隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),肺組織中SOD的活性增加,到第28天時(shí)SOD含量表達(dá)最強(qiáng);肺組織中MDA含量降低,至第28天時(shí)其含量表達(dá)最低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

2.6 KL-6在大鼠肺組織內(nèi)的含量

百草枯大鼠隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),肺組織中KL-6的表達(dá)增加,到第28天時(shí)肺組織內(nèi)的KL-6含量表達(dá)最強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。

圖3 兩組大鼠肺系數(shù)的變化Figure 3 The changes of lung coefficients in the two groups

圖4 兩組大鼠HYP的含量Figure 4 Contents of HYP in rats in two groups

圖5 兩組大鼠肺組織SOD活性和MDA含量的比較Figure 5 Changes of SOD activity and MDA content in lung tissues of rats at different time points in two groups

圖6 各組大鼠肺組織KL-6平均光密度值Figure 6 Average optical density of KL-6 in lung tissue of rats in each group

3 討論

我國(guó)是目前百草枯最大的生產(chǎn)國(guó)以及最大的使用國(guó)[14,16]。百草枯中毒的病死率大約為85%-95%,幸存者亦存在肺纖維化,預(yù)后的效果不理想[17]。百草枯中度的中毒病人在染毒后的1 d內(nèi)會(huì)很快出現(xiàn)急性肺損傷的特征,然后就會(huì)轉(zhuǎn)為急性呼吸窘迫綜合征,如果第7天時(shí)病人仍然為存活的狀態(tài),其肺部損傷就會(huì)出現(xiàn)逐漸加重的狀況,從而發(fā)展為不可逆的肺間質(zhì)纖維化,后期的病人一般死于呼吸衰竭。羥脯氨酸是膠原纖維所具有的特征物。而肺纖維化的前提是膠原纖維,故通過對(duì)羥脯氨酸含量進(jìn)行檢測(cè),從而能夠?qū)δz原含量進(jìn)行間接反映,能夠?qū)⑵渥鳛闄z測(cè)膠原代謝的重要因素。KL-6是一類肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌的大分子唾液酸糖蛋白，大部分于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表面表達(dá)，有佷少部分的表達(dá)在正常肺部組織以及終末細(xì)支氣管肺泡上皮細(xì)胞表面，而其在肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞上并不表達(dá)[18]。肺間質(zhì)性病變病人血清中KL-6黏蛋白的水平與其他呼吸系統(tǒng)疾病病人進(jìn)行對(duì)比,其KL-6黏蛋白的水平出現(xiàn)明顯升高[19]。日本研究學(xué)者的研究結(jié)果表明血清中的KL-6黏蛋白水平比500 U/ml高,是結(jié)締組織病并發(fā)間質(zhì)性肺疾病的特征。此外,活動(dòng)期間質(zhì)性肺病病人與非活動(dòng)期間質(zhì)性肺病病人進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),在活動(dòng)期間質(zhì)性肺病病人的血清中KL-6黏蛋白的水平含量出現(xiàn)明顯升高,而濃度較高的血清中的KL-6黏蛋白水平與迅速進(jìn)展致間質(zhì)性肺病具有直接的關(guān)系。因此,KL-6黏蛋白水平對(duì)于研究這類疾病具有很大價(jià)值[20],KL-6黏蛋白水平的數(shù)值變化能夠直接對(duì)肺病疾病狀態(tài)進(jìn)行反映。此外,百草枯中毒后肺組織中SOD的活性增加,且肺組織內(nèi)的SOD含量表達(dá)增強(qiáng)。這表明百草枯中毒早期以氧化還原損傷的急性炎性滲出損傷為主。而且,本研究發(fā)現(xiàn)肺組織形態(tài)、肺系數(shù)、MDA、SOD、KL-6與肺纖維化的關(guān)系均較密切,故而檢測(cè)百草枯中毒患者血清SOD、MDA和KL-6黏蛋白水平對(duì)判斷中毒程度、指導(dǎo)治療及評(píng)估預(yù)后有其意義。

綜上所述,KL-6黏蛋白參與著肺纖維化的全部發(fā)展過程。關(guān)于KL-6黏蛋白的測(cè)定存在十分重要的臨床意義,這能夠?qū)Ψ卫w維化的初始、發(fā)展以及其嚴(yán)重程度進(jìn)行指導(dǎo)作用,進(jìn)而對(duì)其相關(guān)治療以及判斷預(yù)后制定有價(jià)值的治療方案。