金平 王經(jīng)英 邢小煒 林敏 蔡兆偉 許茂盛 孫志超 佟雅涵

阿爾茨海默?。ˋD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，具有病因多樣、起病隱匿、認(rèn)知功能隨病程進(jìn)展?jié)u進(jìn)性損害等特點(diǎn)。腦部出現(xiàn)老年斑（SPs）是AD的主要病理變化之一，其核心成分是β-淀粉樣蛋白（Aβ），尤其是Aβ1-42在AD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[1]。關(guān)于AD的病因研究一直是臨床的熱點(diǎn)[2]。有研究指出，免疫炎性反應(yīng)、慢性腦缺血在AD的病情進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[3]。筆者團(tuán)隊(duì)早期研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食喂養(yǎng)的AD兔模型中，繼發(fā)于高脂血癥的低血流量灌注與腦組織Aβ1-42的沉積存在明顯的相關(guān)性[4]。因此，筆者有理由假設(shè)免疫炎性反應(yīng)與慢性腦缺血所導(dǎo)致的腦組織Aβ1-42異常沉積有密切關(guān)系。本研究通過建立慢性腦缺血大鼠模型，檢測其腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子和Aβ1-42的表達(dá)水平，分析兩者的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源 選用健康成年普通級(jí)雄性SD大鼠 16 只，24周齡，體重（180±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心普通級(jí)大鼠實(shí)驗(yàn)室[SYXK（浙）2013-0184]提供并飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)籠內(nèi)，12h/12h明暗交替，飼養(yǎng)溫度22～23℃，相對(duì)濕度45%～50%，自由飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 將16只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和假手術(shù)組，各8只。模型組：使用3%戊巴比妥鈉，按45mg/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，永久結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立慢性腦缺血大鼠模型[5]。手術(shù)中使用電熱毯維持大鼠肛溫在（37.0±0.5）℃，手術(shù)后大鼠送至有通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備的動(dòng)物房飼養(yǎng)，術(shù)后3d連續(xù)肌肉注射青霉素20萬U/kg體重，以預(yù)防感染。假手術(shù)組：采用與模型組相同的方法麻醉大鼠，切開其頸部皮膚后分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎，后續(xù)處理同模型組。

1.3 大鼠局部腦血流（rCBF）檢測 使用激光多普勒血流儀分別檢測兩組大鼠手術(shù)前、手術(shù)后（30min內(nèi)）海馬CA1區(qū)rCBF變化情況，測量點(diǎn)定于大鼠右側(cè)外眥與耳孔連線的中點(diǎn)（對(duì)應(yīng)顱內(nèi)右側(cè)顳葉海馬區(qū)域）。具體測量步驟見參考文獻(xiàn)[6]。

1.4 大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 Aβ1-42表達(dá)水平檢測 術(shù)后4周兩組大鼠均使用3%戊巴比妥鈉按45mg/kg腹腔注射麻醉后斷頭處死，再次確認(rèn)模型組大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎情況，確保結(jié)扎絲線沒有滑脫或松弛，頸總動(dòng)脈被牢固結(jié)扎。取出大鼠腦組織并分離海馬，使用均質(zhì)機(jī)（法國Birtin公司）制備10%的腦組織勻漿，4℃環(huán)境下3 000r/min離心10min，取上清液進(jìn)行ELISA法檢測。使用上海巧伊生物科技有限公司提供的IL-1β、IL-6和TNF-α試劑盒以及南京建成生物工程研究所提供的Aβ1-42試劑盒檢測IL-1β、IL-6、TNF-α和Aβ1-42表達(dá)水平。測量步驟嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。

1.5 觀察指標(biāo) （1）比較兩組大鼠手術(shù)前后rCBF；（2）比較兩組大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 Aβ1-42表達(dá)水平；（3）分析大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)水平與Aβ1-42表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以 表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)手術(shù)前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Person相關(guān)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠手術(shù)前后rCBF比較 見表1。

表1 兩組大鼠手術(shù)前后rCBF比較（ml/min）

由表1可見，手術(shù)前兩組大鼠rCBF比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），手術(shù)后模型組大鼠rCBF明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）。模型組大鼠手術(shù)后rCBF明顯低于手術(shù)前（P＜0.05），而假手術(shù)組大鼠手術(shù)前后rCBF比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 兩組大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α和 Aβ1-42表達(dá)水平比較 見表2。

由表2可見，模型組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，Aβ1-42表達(dá)水平亦高于假手術(shù)組，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平與Aβ1-42表達(dá)水平的相關(guān)性分析 見圖1-3。

表2 兩組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α和Aβ1-42表達(dá)水平比較

圖1 大鼠腦組織IL-1β表達(dá)水平與Aβ1-42表達(dá)水平的散點(diǎn)圖

圖2 大鼠腦組織IL-6表達(dá)水平與Aβ1-42表達(dá)水平的散點(diǎn)圖

圖3 大鼠腦組織IL-6表達(dá)水平與Aβ1-42表達(dá)水平的散點(diǎn)圖

由圖 1-3可見，大鼠腦組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)水平與Aβ1-42表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r=0.7755、0.5920、0.5536，均P＜0.05）。

3 討論

慢性腦缺血是指因各種原因所引起的慢性腦血流灌注不足導(dǎo)致的一組疾病，是AD等導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙疾病的共同病理基礎(chǔ)[7]。目前學(xué)界普遍認(rèn)為AD是一種神經(jīng)退行性疾病，但長時(shí)間的腦部低血流灌注會(huì)促使AD的發(fā)生。Torre[8]提出AD的臨界腦低血流灌注閾值學(xué)說，指出當(dāng)腦血流灌注因?yàn)楦鞣N原因降至一定的閾值以后，便可以通過觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使腦組織出現(xiàn)一系列的類似AD的病理改變。早有研究指出，通過結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈所建立的慢性腦缺血大鼠模型與散發(fā)性AD患者在認(rèn)知功能的損傷、腦血管的異常改變和神經(jīng)元變性等諸多方面的存在相似[5，8]。研究者還在慢性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ湍X內(nèi)發(fā)現(xiàn)Aβ和淀粉樣前體蛋白（APP）濃度明顯上升[9-10]，而腦組織的Aβ，尤其是Aβ1-42的異常增高和沉積是AD的特征性主要病理改變之一。

參考Smith等[11]提出的AD腦萎縮假說，筆者團(tuán)隊(duì)采用雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎的方法成功制備大鼠腦缺血模型，檢測兩組大鼠腦組織Aβ1-42表達(dá)水平。結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織Aβ1-42水平較假手術(shù)組大鼠明顯升高，與以往研究結(jié)果相符[9-10]。慢性腦缺血可以在提高β-分泌酶活性強(qiáng)化APP的淀粉樣途徑的同時(shí)，降低α-分泌酶活性，從而使非淀粉樣途徑受到抑制，最終使Aβ蛋白生成增加[10]。Ballabh等[12]指出腦缺血可以使糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)蛋白表達(dá)明顯增多，RAGE通過內(nèi)吞或跨膜作用，將腦組織外的Aβ通過血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)入腦，使腦組織的Aβ表達(dá)水平增高。沉積在小動(dòng)脈與毛細(xì)血管基膜上的Aβ則通過增強(qiáng)內(nèi)皮素的縮血管作用引起腦組織供血?jiǎng)用}和毛細(xì)血管收縮，進(jìn)一步加重腦的低血流灌注，從而發(fā)生互相促進(jìn)的惡性循環(huán)[13]。

神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)被認(rèn)為是慢性腦缺血發(fā)生、發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，發(fā)生慢性腦缺血時(shí)，顱內(nèi)的神經(jīng)免疫炎性細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等出現(xiàn)增生和活化，活化后的膠質(zhì)細(xì)胞既對(duì)神經(jīng)元有支持和營養(yǎng)作用，又因分泌大量的TNF-α、IL-1、IL-6等免疫炎性因子而進(jìn)一步加劇神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)，使神經(jīng)元損傷加重[14-15]。本研究結(jié)果顯示，慢性腦缺血模型大鼠腦組織的IL-1β、IL-6和TNF-α等免疫炎性因子表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯增高，這與有關(guān)研究的結(jié)果相符[14]。

免疫炎性反應(yīng)貫穿了AD的整個(gè)發(fā)生、發(fā)展過程[16]。Aβ蛋白在腦組織中異常沉積可形成神經(jīng)炎性斑（SPs）。SPs形成過程中其周圍總是存在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的明顯增生、活化以及免疫炎性因子的分泌，提示Aβ可以誘導(dǎo)包括小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，促使其釋放炎性因子和神經(jīng)元毒性介質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元損害[17]。本研究結(jié)果顯示，大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子表達(dá)水平與Aβ1-42表達(dá)水平均呈正相關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1是AD神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)的標(biāo)志物，在整個(gè)炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用，而且與AD的病情嚴(yán)重程度存在明顯的相關(guān)性[18]。IL-1有IL-1α和IL-1β兩種，其中IL-1β的過表達(dá)和過度釋放是AD免疫炎性損傷的起始因素[19]。過表達(dá)的IL-1β不僅可以通過蛋白激酶C（PKC）途徑促進(jìn)APP的合成和裂解[20]，加速腦內(nèi)Aβ的形成和沉積，還可使環(huán)氧化酶（COX1、COX2）合成增多[21]，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致患者認(rèn)知功能損傷。

TNF-α的過表達(dá)也與AD存在明顯的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血和腦脊液TNF-α表達(dá)水平較正常人群明顯升高[22]；TNF-α的過表達(dá)可以加速Aβ形成和沉積，導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷[23]。TNF-α不僅可以通過激活Caspases家族成員引起神經(jīng)元凋亡，還可以誘導(dǎo)花生四烯酸代謝物的釋放、脂質(zhì)過氧化物和氧自由基的產(chǎn)生，破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；此外TNF-α還可以協(xié)同IL-1β誘導(dǎo)IL-6等其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生[24]。

IL-6在AD疾病起始階段就可以出現(xiàn)升高，是AD發(fā)病的的危險(xiǎn)因素[25]。IL-6主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞合成，可以刺激小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子。IL-6可以通過促使神經(jīng)元APP mRNA表達(dá)升高，從而使APP生成增加[26]；還可以通過誘導(dǎo)α2巨球蛋白合成，抑制腦組織Aβ的清除，導(dǎo)致腦組織Aβ的異常沉積。此外，Qiu等[27]發(fā)現(xiàn)IL-6還與Aβ在AD的疾病進(jìn)展中存在協(xié)同促進(jìn)作用。

綜上所述，慢性腦缺血大鼠腦組織存在IL-1β、IL-6和TNF-α等免疫炎性因子表達(dá)水平與Aβ1-42表達(dá)水平升高的現(xiàn)象，且免疫炎性因子表達(dá)水平與Aβ1-42表達(dá)水平呈正相關(guān)。慢性腦缺血或可促使腦組織Aβ1-42表達(dá)水平上升和異常沉積，免疫炎性反應(yīng)或與慢性腦缺血所導(dǎo)致的腦組織Aβ1-42異常沉積有關(guān)。當(dāng)然，本研究也存在不足之處，如未對(duì)兩組大鼠進(jìn)行行為學(xué)比較，未對(duì)大鼠腦內(nèi)是否存在AD的特征性病理改變進(jìn)行觀察，筆者團(tuán)隊(duì)將在今后作進(jìn)一步研究和更深入的探討。