郭文利 黃建棋 陸建菊 陸凱

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，也是我國女性第二位常見的惡性腫瘤，且近年來我國乳腺癌發(fā)病率呈迅速上升趨勢[1]。一大部分乳腺癌患者被確診時已處于癌癥進展期，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因，因此預(yù)防或減緩乳腺癌的進展和轉(zhuǎn)移對于改善患者的預(yù)后有重要意義[2]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受關(guān)注，lncRNA在多種腫瘤組織中表達失調(diào)，通過調(diào)控癌基因或抑癌基因的表達影響腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移[3-6]。AC003973.4是一個編碼1 394個核苷酸的lncRNA。本研究通過檢測AC003973.4在乳腺癌組織和細(xì)胞株中的表達情況，分析AC003973.4對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討AC003973.4與乳腺癌進展和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基和FBS購自美國Gibco公司；人乳腺癌細(xì)胞株BT-549、MDA-MB-231、MCF-7、T47D和正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A均購自中國科學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)中心；過表達AC003973.4的質(zhì)粒（pcDNA3.1-AC003973.4）和陰性對照質(zhì)粒購自上海吉瑪生物技術(shù)公司；Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒和引物購自上海生工生物工程公司；MTS試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrige基質(zhì)膠購自美國 BD 公司；抗 PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin及β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗標(biāo)本 本研究經(jīng)嘉興市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。20例乳腺癌組織和配對的癌旁組織標(biāo)本來源于2015年3月至2017年9月本院乳腺外科收治的行手術(shù)切除治療的乳腺癌患者，癌旁組織取距腫瘤邊緣＞1cm且＜3cm的組織。組織標(biāo)本于手術(shù)切除后均迅速冷凍保存，且患者術(shù)前均未接受放化療，術(shù)后病理學(xué)檢查確診乳腺癌。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 BT-549和MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，MDA-MB-231、T47D和MCF-10A細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，參照脂質(zhì)體Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染說明書進行操作。將MCF-7細(xì)胞以每孔4×105個接種于6孔板，待匯合度為60%時，分別將pcDNA3.1-AC003973.4質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞，分別為實驗組和對照組，繼續(xù)培養(yǎng)12h后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3.2 qRT-PCR 檢測 AC003973.4、miR-224-5p和PTEN mRNA表達水平 使用Trizol試劑對組織和細(xì)胞進行RNA抽提。分光光度儀檢測RNA濃度和純度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行qRT-PCR反應(yīng)，分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，檢測AC003973.4、miR-224-5p和PTEN mRNA的相對表達水平。qRT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA 2μl、混合液 10μl、上下游引物各 2μl、雙蒸水2μl。反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 10min、59℃ 30s、72℃ 30s，共35個循環(huán)。AC003973.4的上游序列為 5′-TCTTTCCTCAGGAGGTATTGTGA-3′，下游序列為 5′-CACATCACCAAGGTTCTGGTT-3′；PTEN 的上游序列為 5′-AGGGACGAACTGGTGTAATGA-3′，下游序列為 5′-CTGGTCCTTACTTCCCCATAGAA-3′；GAPDH 的上游序列為 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；U6 的上游序列為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游序列為 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-224-5p 的上游序列為 5′-GGGTCAAGTCACTAGTGGTTCC-3′，下游序列為 5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。

1.3.3 MTS法檢測細(xì)胞增殖能力 取轉(zhuǎn)染后狀態(tài)良好的實驗組和對照組MCF-7細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞，培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為 1×104個/ml，以 2×103個/孔重新接種于96孔板。使用MTS試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力，避光條件下，每孔加入濃度為15%的MTS試劑10μl，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2h，酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm波長處的光密度（D）值。以接種后12h為MTS實驗的第0d，分別檢測第0、1、2、3、4 d的細(xì)胞增殖能力。實驗重復(fù)4次。

1.3.4 Transwell遷移實驗檢測細(xì)胞遷移能力 取轉(zhuǎn)染后狀態(tài)良好的實驗組和對照組MCF-7細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105個/ml，將細(xì)胞懸液以 200μl/孔加入 Transwell上室，下室加入600μl含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24h后，取出上室，用95%的甲醇溶液固定，用0.1%

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織、乳腺癌細(xì)胞株與正常乳腺上皮細(xì)胞株AC003973.4表達水平比較 見圖1、2。

由圖1可見，AC003973.4在乳腺癌組織中表達水平明顯低于癌旁組織[（1.48±0.12）vs（5.53±0.24），P＜0.01]。由圖2可見，AC003973.4在乳腺癌細(xì)胞株BT-549（0.41 ± 0.08）、MDA-MB-231（0.73 ± 0.04）、MCF-7（0.17± 0.04）和T47D（0.49± 0.04）中呈低表達，而在人正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A（1.00±0.07）中呈高表的結(jié)晶紫溶液染色，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，取4個視野（×100）計數(shù)基底膜細(xì)胞數(shù)，計算平均值。實驗重復(fù)4次。

1.3.5 Transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲能力 在Transwell上室鋪Matrige基質(zhì)膠40μl/孔，培養(yǎng)箱內(nèi)靜置5h風(fēng)干后，其余操作同Transwell遷移實驗。

1.3.6 生物信息學(xué)法預(yù)測AC003973.4互補結(jié)合的miRNA及下游靶基因 采用LncBase Predicted v.2軟件分析AC003973.4可互補結(jié)合的miRNA，采用TargetScan Release 7.2軟件預(yù)測miRNA的下游靶基因。

1.3.7 Western blot法檢測細(xì)胞PTEN蛋白、細(xì)胞增殖與遷移相關(guān)蛋白表達水平 取轉(zhuǎn)染后狀態(tài)良好的實驗組和對照組MCF-7細(xì)胞，PBS溶液洗滌后，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，測定蛋白濃度。每組取45μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉。TBST溶液洗膜后加入Ⅰ抗冰箱內(nèi)孵育過夜，Ⅰ抗稀釋比例分別為PTEN（1∶1 000）、CDK4（1∶1 500）、Cyclin D1（1∶500）、Zeb-1（1∶500）、N-cadherin（1∶500）及 β-actin（1∶2 000）。TBST溶液洗膜后，加入Ⅱ抗室溫孵育。TBST溶液洗膜后，加入顯影液顯影。β-actin為內(nèi)參蛋白，實驗重復(fù)4次。

1.4 觀察指標(biāo) （1）比較乳腺癌組織與癌旁組織、乳腺癌細(xì)胞株與正常乳腺上皮細(xì)胞株AC003973.4表達水平；（2）比較實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞AC003973.4表達水平；（3）比較實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞增殖能力、遷移、侵襲能力；（4）觀察AC003973.4互補結(jié)合的miRNA及下游基因預(yù)測結(jié)果；（5）比較實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞miR-224-5p、PTEN mRNA表達水平與PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin 蛋白表達水平。達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），在MCF-7細(xì)胞中表達水平最低（P＜0.01）。

圖1 乳腺癌組織與癌旁組織AC003973.4表達水平比較（**P＜0.01）

圖2 乳腺癌細(xì)胞株和正常乳腺上皮細(xì)胞株AC003973.4表達水平比較（與 MCF-10A 細(xì)胞株比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞AC003973.4表達水平比較 見圖3。

圖3 實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞AC003973.4表達水平比較（**P＜0.01）

由圖3可見，實驗組MCF-7細(xì)胞AC003973.4表達水平明顯高于對照組[（7.50±0.75）vs（1.02±0.10），P＜0.01]，即轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-AC003973.4質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞AC003973.4的表達水平明顯上調(diào)。

2.3 實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞增殖能力比較 見圖4。

圖4 實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞增殖能力比較（*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖 4 可見，第 1、2、3、4d，實驗組 MCF-7 細(xì)胞的D 值分別為 0.42±0.03、0.63±0.03、1.02±0.07、1.21±0.06，對照組MCF-7細(xì)胞的D值分別為 0.59±0.05、0.90±0.07、1.47±0.06、1.58±0.07，實驗組 MCF-7 細(xì)胞的 D 值均低于對照組（均P＜0.05），即上調(diào)AC003973.4的表達水平可減弱MCF-7細(xì)胞的增殖能力。

2.4 實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞遷移能力比較 見圖5。

由圖5可見，實驗組MCF-7細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組[（126.70±15.47）個/視野vs（229.30±13.59）個/視野，P＜0.01]，即上調(diào) AC003973.4 的表達水平可減弱MCF-7細(xì)胞的遷移能力。

圖5 實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞遷移能力比較（a：光學(xué)顯微鏡下所見，結(jié)晶紫染色，×100；b：穿膜細(xì)胞數(shù)比較，**P＜0.01）

2.5 實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞侵襲能力比較 見 圖6。

圖6 實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞侵襲能力比較（a：光學(xué)顯微鏡下所見，結(jié)晶紫染色，×100；b：穿膜細(xì)胞數(shù)比較，*P＜0.05）

由圖6可見，實驗組MCF-7細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組[（37.33±8.32）個/視野vs（70.56±4.71）個/視野，P＜0.05]，即上調(diào)AC003973.4的表達水平可減弱MCF-7細(xì)胞的侵襲能力。2.6 AC003973.4互補結(jié)合的miRNA及下游基因預(yù)測結(jié)果 用LncBase Predicted v.2軟件預(yù)測的結(jié)果表明，AC003973.4可互補結(jié)合miR-224-5p。TargetScan Release 7.2軟件預(yù)測結(jié)果表明，miR-224-5p可互補結(jié)合的下游靶基因為 PTEN，mirSVR score 為-0.7800，Phast－Cons score為 0.5133，見圖 7。

圖7 AC003973.4互補結(jié)合的miRNA及下游基因預(yù)測結(jié)果

2.7 實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞miR-224-5p、PTEN mRNA表達水平比較 實驗組MCF-7細(xì)胞miR-224-5p表達水平明顯低于對照組[（0.30±0.07）vs（1.00±0.06），P＜0.01]，實驗組MCF-7細(xì)胞PTEN mRNA表達水平明顯高于對照組[（5.51±0.44）vs（1.00±0.06），P＜0.01]，即上調(diào)AC003973.4表達水平可抑制MCF-7細(xì)胞miR-224-5p的表達，促進PTEN mRNA的表達。

2.8 實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin蛋白表達水平比較 見圖8。

圖8 實驗組與對照組MCF-7細(xì)胞PTEN、CDK4、Cyclin D1、Zeb-1、N-cadherin蛋白表達水平比較（a：各蛋白電泳圖；b：兩組細(xì)胞各蛋白表達水平比較，**P＜0.01）

由圖8可見，實驗組MCF-7細(xì)胞PTEN蛋白表達水平高于對照組（P＜0.01），細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CDK4、Cyclin D1與細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白Zeb-1、N-cadherin表達水平均低于對照組（均P＜0.01），即實驗組MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均減弱。

3 討論

lncRNA是一類長度超過200個核苷酸、自身不編碼蛋白的RNA，以往認(rèn)為lncRNA沒有實際作用，然而近來研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用，可通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控細(xì)胞功能[7-8]，在多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)表達異常的lncRNA，lncRNA可能廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。眾多l(xiāng)ncRNA如SNHG15、SNHG16、MEG3被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中表達上調(diào)或下調(diào)，在乳腺癌中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用[10-12]。AC003973.4是一種新發(fā)現(xiàn)的尚不清楚作用的lncRNA。

本研究結(jié)果表明，在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞株中AC003973.4的表達水平分別明顯低于癌旁組織和正常乳腺上皮細(xì)胞。上調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中AC003973.4的表達水平后，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均明顯被抑制。以上結(jié)果提示，AC003973.4的異常表達可能參與調(diào)控乳腺癌的進展和轉(zhuǎn)移。目前研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA發(fā)揮作用的重要機制之一是通過吸附可互補結(jié)合的miRNA，減少下游miRNA的表達，發(fā)揮“海綿”作用[13]。miRNA是一類長度約為19～25個核苷酸的非編碼RNA，可互補結(jié)合下游靶基因mRNA，干擾下游基因的表達[14-15]。lncRNA可通過減少miRNA的表達，干擾miRNA對下游靶基因的抑制作用。本研究應(yīng)用LncBase Predicted v.2軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AC003973.4可互補結(jié)合miR-224-5p。本研究上調(diào)MCF-7細(xì)胞AC003973.4表達水平后，miR-224-5p的表達降低，表明AC003973.4可能具有吸附miR-224-5p的作用。miR-224-5p在胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、宮頸癌中呈高表達水平，具有促進腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用，表現(xiàn)為癌基因[14，16-17]。本研究利用TargetScan Release 7.2軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-224-5p可互補結(jié)合PTEN。PTEN基因是目前發(fā)現(xiàn)的第一個具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因，其表達下調(diào)可干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架重構(gòu)[18]。PTEN是近年來抑癌基因研究的熱點之一，在包括乳腺癌在內(nèi)的人類大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[19]。上調(diào)PTEN基因的表達后，乳腺癌等腫瘤進展和轉(zhuǎn)移明顯減緩[20]。本研究結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞miR-224-5p表達下調(diào)后，PTEN基因的表達上調(diào)，PTEN蛋白表達上調(diào)的同時，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CDK4和Cyclin D1的表達下調(diào)，細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白Zeb-1和N-cadherin的蛋白表達下調(diào)，表明MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均下降。

綜上所述，AC003973.4在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞中的表達下調(diào)，上調(diào)AC003973.4的表達可減弱MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能為AC003973.4吸附并降低miR-224-5p的表達，從而干擾miR-224-5p對PTEN抑癌基因的抑制作用。AC003973.4可能為乳腺癌進展和轉(zhuǎn)移潛在的預(yù)測分子和治療靶點。