李婷婷 蔡彩虹 郭志凱 戴好富 夏志輝 曾艷波③

(1 海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗室 海南海口571101;2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗室 海南海口571101;3 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院 海南?？?70228)

冰菜（Mesembryanthemum crystallinumL.）屬番杏科日中的一年生草本植物，又名冰葉日中花、冰草、冰花、水晶冰菜［1］。冰菜原產(chǎn)于南非納米比沙漠等干旱地區(qū)，現(xiàn)在非洲、亞洲西部和歐洲等地區(qū)均有分布［2］。國內(nèi)目前也在引種栽培，在云南、陜西、山東等地區(qū)已經(jīng)有了冰菜的規(guī)?；N植［3］。冰菜因其葉子和莖的表面有大量凸起的鹽囊泡細(xì)胞，在陽光照射下反射光線，看起來像冰晶一樣美麗而得名［4］。近年來，隨著生活水平不斷提高，人們對具有保健作用的蔬菜越來越重視。冰菜中含有多種碳水化合物以及有機(jī)酸、酚類化合物、天然蘋果酸、黃酮類化合物等，并且還含有鉀、鈣、鈉等多種礦物質(zhì)成分，是具有高營養(yǎng)價值的功能性蔬菜。并具有清除自由基和抗氧化活性、促進(jìn)代謝、預(yù)防脂肪肝和動脈硬化、減緩糖尿病等功效［5-8］。

早老性癡呆癥（又稱阿爾茨海默氏?。┦且园ㄓ洃浐驼J(rèn)知功能在內(nèi)的智力逐漸衰退為特征的致殘性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。它是老年人中最常見的癡呆類型，占所有癡呆病例的50%～75%，包括智力損傷、人格變化、精神錯亂，最終導(dǎo)致癡呆并失去理智和自理能力［9-10］。本癥的發(fā)病機(jī)制原因很多，目前尚不明確，認(rèn)為是一種由多種病因引起的疾病，目前人們最為廣泛研究和接受的是“膽堿能缺失學(xué)說”［11-12］。乙酰膽堿酯酶是膽堿能神經(jīng)纖維信號傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性的酶，在膽堿能突觸間，主要負(fù)責(zé)在膽堿能突觸釋放后1毫秒內(nèi)快速消除乙酰膽堿，從而可以精確控制肌肉收縮，來保證生物體內(nèi)神經(jīng)信號的正常傳遞［13-14］。乙酰膽堿酯酶抑制劑是目前研究最多，作為治療老年性癡呆癥的一線藥物，并且只有6 種藥物獲得美國FDA 許可上市：他克林、利斯的明、多奈哌齊、加蘭他敏、石杉堿甲和N-甲基-D-天冬氨酸受體阻滯劑美金剛。目前研究發(fā)現(xiàn)，他克林具有很強(qiáng)的副作用，尤其是肝臟毒性明顯，其余藥物也只能作用于輕度或中度早老性癡呆患者，起到減緩作用，并不能很好地進(jìn)行治療。目前，其他的抑制劑正在研發(fā)中，使用乙酰膽堿酯酶抑制劑來治療由阿爾茨海默氏病引起的膽堿能失衡癥狀是一種合理的辦法［15-17］。因此，以天然產(chǎn)物為原料，尋找具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的植物源藥物成為關(guān)鍵。

目前，國內(nèi)外對冰菜的研究主要集中在冰菜的營養(yǎng)價值、栽培種植以及景天酸代謝方面，冰菜作為兼性鹽生植物，具有很強(qiáng)的耐鹽性和耐旱性［18］。國外研究者常把冰菜作為景天酸代謝分子遺傳研究的有用模型［19］。而對其生物活性研究較少，本研究對冰菜的乙醇提取物及其乙醇提取物萃取后的四個部分的乙酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行了研究，旨在為冰菜的有效開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

冰菜樣品于2018 年5 月采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所文昌耐鹽蔬菜種植基地。標(biāo)本存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所B502實(shí)驗室。

儀器及試劑：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社）；安捷倫1260分析型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；電子計重秤（廈門佰倫斯電子科技有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；超純水裝置（廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司）；乙酰膽堿酯酶、他克林（Sigma 公司）；常用分析純有機(jī)溶劑（廣州化工和天津大茂公司）；濃硫酸（博濱嶺化工有限公司）；色譜溶劑（天津四友和天津康科德公司）；其他試劑均為重蒸工業(yè)試劑。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

將冰菜（50.0 kg）用閘刀切成2～3 cm 的小段，置于塑料桶內(nèi)，用食用酒精提取3 次，將3 次浸泡得到的提取液合并，用濾紙過濾掉殘渣，得到冰菜提取液，之后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀經(jīng)減壓濃縮得到提取物浸膏（200.0 g）。將提取物用超純水溶解，使其均勻分散成乳濁液，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，并分別經(jīng)減壓濃縮得到石油醚部分（96.6 g）、乙酸乙酯部分（18.0 g）、正丁醇部分（75.0 g）和水部分。

1.2.2 活性測試

采用Ellman 法［20-21］測定乙酰膽堿酯酶抑制活性，冰菜乙醇提取物、以及萃取后的石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分均用DMSO 進(jìn)行溶解，取110.0 μL 磷酸緩沖液（pH8.0）、10 μL待測樣品（50.0 μg/mL）和40.0 μL 乙酰膽堿酯酶（0.02 μg/mL）于96 孔板中，30.0℃恒溫20.0 min后加入DTNB（2.48 mg/mL）和碘化硫代乙酰膽堿（1.81 mg/mL）等體積混合液40.0 μL，反應(yīng)體系總共200.0 μL，30.0 min后，405 nm處用酶標(biāo)儀檢測吸光度（A）值，陽性對照為他克林，反應(yīng)終質(zhì)量濃度為0.08 μg/mL，陰性對照為DMSO，終濃度為0.1%，實(shí)驗重復(fù)3次，按照公式計算化合物對乙酰膽堿酯酶的抑制率：

抑制率＝（E－S）/E，

式中，E為陰性對照平均A值，S為待測樣品的平均A值。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

冰菜乙醇提取物、以及萃取后的石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分的乙酰膽堿酯酶抑制活性數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步計算后，所有的試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan 氏多重比較，試驗結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

采用Ellman 法［20-21］測定冰菜乙醇提取物、以及萃取后的石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分的乙酰膽堿酯酶抑制活性，結(jié)果表明，以他克林為陽性對照，冰菜乙醇提取物及萃取后各部分中，除水部分無活性外，其余各部分均有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性（表1）。石油醚部分乙酰膽堿酯酶抑制率最強(qiáng)，為（77.72±3.30）%。乙酸乙酯部分具有一定的乙酰膽堿酶抑制活性，抑制率為（48.38±1.28）%。乙醇提取物（16.03±0.12）% 和 正 丁 醇 部 分（30.06±0.79）%對乙酰膽堿酯酶抑制活性較弱。水部分沒有檢測到乙酰膽堿酯酶抑制活性。石油醚部分乙酰膽堿酯酶抑制率最強(qiáng)，達(dá)到（77.72±3.30）%，較陽性對照組他克林的抑制活性高出4%左右，對冰菜乙醇提取物及萃取后各部分和他克林對乙酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行t檢驗發(fā)現(xiàn)，石油醚部分與陽性對照的顯著性為0.013，差異達(dá)顯著水平（p＜0.05），說明石油醚部分中可能含有可以抑制乙酰膽堿酯酶活性的物質(zhì)，值得進(jìn)一步分離。乙酸乙酯部分、乙醇提取物和正丁醇部分對乙酰膽堿酯酶抑制活性與對照組顯著性均為0，差異達(dá)顯著水平（p＜0.05），對乙酰膽堿酯酶抑制活性較弱。

表1 冰菜乙醇提取物及四個萃取部分的乙酰膽堿酯酶抑制活性

3 討論與結(jié)論

隨著世界人口逐漸老齡化，越來越多的人有患阿爾茨海默病的風(fēng)險。據(jù)調(diào)查，2006 年，全球約2 660 萬人患有阿爾茨海默病。預(yù)計到2050 年，這一數(shù)字將翻兩番，超過1億人患有該?。?2-23］。目前已經(jīng)批準(zhǔn)上市的6種臨床常用的乙酰膽堿酯酶抑制劑都伴隨著不同程度的不良反應(yīng)，例如惡心、頭暈、嘔吐、腹瀉、唾液增多以及肌無力等癥狀［24］。從天然植物中提取乙酰膽堿酯酶抑制劑已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，國外研究者從多種植物中篩選出一些具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質(zhì)，主要是生物堿類、萜類、天然黃酮類等化合物，其中主要用于臨床治療阿爾茨海默病的藥物，其活性成分主要都為生物堿類，其余種類化合物抑制活性較低［25］。本研究發(fā)現(xiàn)了冰菜中可能含有具有良好乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質(zhì)，特別是冰菜乙醇提取物的石油醚萃取物表現(xiàn)出了與陽性對照他克林相近的乙酰膽堿酯酶抑制活性，由此猜測，如果可以從冰菜乙醇粗提物的石油醚部分中分離得到對乙酰膽堿酯酶具有抑制活性的化合物，則該化合物有潛力發(fā)展成為一個有效的、具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的先導(dǎo)化合物。因此，在接下來的工作中，主要以乙酰膽堿酯酶抑制活性為導(dǎo)向，對冰菜乙醇提取物的石油醚萃取部分以及乙酸乙酯部分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，以期可以得到具有該活性的化合物?？傮w來說，冰菜除了具有豐富的營養(yǎng)價值，被用于食用外，其中含有的一系列的藥理活性物質(zhì)同樣值得以活性為導(dǎo)向去分離，篩選并發(fā)掘其中具有生物活性的成分，為更好地開發(fā)與利用冰菜提供理論基礎(chǔ)。