吳 瓊 王明月 呂岱竹 吳曉春 葛會(huì)林
(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱作產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(???/海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南???71101)
丙環(huán)唑是一種既有保護(hù)作用又有治療作用的內(nèi)吸性三唑類殺菌劑,可被根莖葉部吸收,并很快地在植物體內(nèi)向上傳導(dǎo)。其作用機(jī)理是影響甾醇的生物合成,使病原菌的細(xì)胞膜功能受到破壞,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,從而起到殺菌、防病和治病的功效。嚴(yán)重的香蕉葉斑病會(huì)影響香蕉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2],丙環(huán)唑是防治香蕉葉斑病的主要農(nóng)藥品種之一,在香蕉種植過程中被大量施用[3-5]。經(jīng)查詢中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng),丙環(huán)唑在我國(guó)登記的作物主要有水稻、小麥、玉米、大豆、油菜、馬鈴薯、茭白、蓮藕、枇杷、花生、蘋果、香蕉、榛子和人參等。CAC 標(biāo)準(zhǔn)中制定的香蕉上丙環(huán)唑MRL 為0.1 mg/kg;美國(guó)環(huán)??偸穑‥PA)制定的MRL 為0.2 mg/kg;歐盟標(biāo)準(zhǔn)中的MRL 為0.1 mg/kg;日本2015 年實(shí)施的“肯定列表制度”對(duì)香蕉中丙環(huán)唑的限量為0.1 mg/kg;中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)香蕉中丙環(huán)唑的MRL為1 mg/kg[6]。
國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的丙環(huán)唑殺菌劑殘留量的檢測(cè)方法有氣相色譜法[7-9]、高效液相色譜法[10]、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]等。如:侯志廣等[13]應(yīng)用氣相色譜儀測(cè)定稻米中丙環(huán)唑和咪鮮胺的殘留量;徐妍等[14]應(yīng)用高效液相色譜儀測(cè)定丙環(huán)唑原藥的殘留;葉倩等[15]利用QuEChERS法對(duì)葉菜進(jìn)行前處理,再用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定葉菜中丙環(huán)唑的殘留量。目前,關(guān)于丙環(huán)唑的研究多數(shù)集中在田間藥效和水稻中的殘留分析上,對(duì)于應(yīng)用氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定香蕉及其土壤中的殘留情況目前報(bào)道較少。鑒于此,本研究建立了丙環(huán)唑在香蕉和土壤中殘留及消解動(dòng)態(tài)的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法,并于海南和云南兩地進(jìn)行了田間試驗(yàn),以期為評(píng)價(jià)丙環(huán)唑在香蕉上的安全使用,確保該藥的科學(xué)合理使用提供理論依據(jù)。
1.1.1 試驗(yàn)材料
(1)供試作物品種:海南省??谑?,泰國(guó)蕉;云南省玉溪市,巴西蕉。
(2)試驗(yàn)藥劑:11.7%丙環(huán)唑懸浮劑。
1.1.2 儀器、試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
(1)儀器設(shè)備:控溫控壓全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海豫康科教儀器;氮吹儀,北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司;離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;固相萃取柱Strata Florisil (55 μm,70 A)。
(2)主要試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):無水硫酸鈉,分析純;乙腈和正己烷均為色譜純;3 mL/500 mg;丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.5%,德國(guó)DR.Ehrensorfer。
1.2.1 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)
按有效成分用藥量375 mg a.i/kg(500 倍液)于香蕉生長(zhǎng)到成熟個(gè)體一半大小時(shí)施藥,施藥時(shí)應(yīng)保證用于動(dòng)態(tài)試驗(yàn)的香蕉均勻著藥,于施藥后2、24、72、168、336、504、672、1008、1440 h
采樣,處理重復(fù)3次,處理間設(shè)保護(hù)隔離區(qū),另設(shè)清水空白對(duì)照。
1.2.2 最終殘留試驗(yàn)
按推薦劑量有效成分丙環(huán)唑用藥量250 mg a.i/kg(750 倍液),高劑量按有效成分丙環(huán)唑用藥量375 mg a.i/kg(500 倍液)施藥。各設(shè)3 次和4 次施藥,施藥間隔期為10 d,每個(gè)處理重復(fù)3 次,小區(qū)設(shè)3棵樹。采樣時(shí)間距離最后一次噴藥的間隔時(shí)間為28、35、42 d。另設(shè)清水空白對(duì)照,處理間設(shè)保護(hù)帶。
1.2.3 樣品的制備與保存
(1)香蕉全果:田間樣本去凈表面雜質(zhì),剪去果柄,切段放入搗碎機(jī),勻漿混勻,用四分法縮分,分取250 g 樣品兩份,分別裝入樣品容器中,貼好實(shí)驗(yàn)室樣號(hào)標(biāo)簽,貯存于-20 ℃冰柜中。
(2)香蕉蕉肉:用刀具縱向?qū)⑾憬肚蟹殖蓛砂辏贸鬃尤〕鼋度夥湃霌v碎機(jī),勻漿混勻用四分法縮分,分取250 g 樣品兩份,分別裝入樣品容器中,貼好實(shí)驗(yàn)室樣品標(biāo)簽。
(3)土壤:田間樣本過篩混勻后采用四分法留樣500 g 兩份,分別裝入樣品容器中,貼好實(shí)驗(yàn)室樣號(hào)標(biāo)簽,貯存于-20 ℃冰柜中保存。
1.2.4 樣品提取
(1) 香蕉全果及蕉肉樣品:稱取(20.00±0.10)g勻漿后的香蕉樣品,置于50 mL 離心管中,加入40.0 mL 乙腈,高速振蕩5 min 后,加入約6 g NaCl,繼續(xù)高速震蕩5 min,10 000 r/min離心5 min,準(zhǔn)確吸取上清液5.0 mL 于50 mL 圓底燒瓶中,氮吹儀吹干,待凈化。
(2)土壤樣品:稱?。?0.00±0.10)g 已過篩的土壤樣品,置于100 mL塑料瓶中,加入40.0 mL乙腈,10.0 mL水,在往復(fù)式振蕩器上振蕩提取1 h后加入約6 g NaCl,蓋上蓋子,劇烈震蕩5 min,在室溫下靜置不少于30 min,準(zhǔn)確吸取上清液5.0 mL 于50 mL 圓底燒瓶中,氮吹儀吹干,待凈化。
1.2.5 樣品凈化
在Strata Florisil SPE 小柱中加入適量無水硫酸鈉,加樣前先分別用3 mL正己烷/丙酮(V/V=3/7)和3 mL 正己烷預(yù)洗柱,當(dāng)液面到達(dá)無水硫酸鈉的頂部時(shí),迅速將1.2.4待凈化提取液轉(zhuǎn)移至凈化柱上,再用3 mL 正己烷/丙酮(V/V=3/7)洗滌圓底燒瓶3次,并移入柱中洗脫農(nóng)藥,合并于接收瓶中,在40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約0.5 mL,用1.5 mL 正己烷溶劑交換2 次,殘留物用正己烷溶解,準(zhǔn)確至2.5 mL,待上機(jī)。
1.2.6 氣相色譜條件
Thermo Trace Ultra,配Thermo RSH Triplus自動(dòng)進(jìn)樣器,Xcalibur 軟件;色譜柱:HP-5MS,0.25 μm,0.25 mm×30 mm;流速:1.0 mL/min;載氣:氦氣,純度≥99.999 %;進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣口溫度:260 ℃;
程序升溫:100 ℃,保持1 min,20 ℃/min 升至260 ℃,保持4 min,再以40 ℃/min 升至280 ℃,保持10 min;進(jìn)樣方式:無分流進(jìn)樣,3 min后打開閥。
1.2.7 質(zhì)譜條件
Thermo DSQII ;電子轟擊源:70 eV;電子源溫度:250 ℃;GC-MS接口溫度:280 ℃。
1.2.8 分析方法
先用SCAN方式對(duì)丙環(huán)唑進(jìn)行定性,確定其保留時(shí)間(RT)、起始采集時(shí)間和定量離子,見表1。
用正己烷配制100 μg/mL 丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)母液,并用空白基質(zhì)逐級(jí)稀釋成0.8、0.16、0.08、0.064、0.032 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣分析,外標(biāo)法定量。
表1 GC-MS/SIM分析丙環(huán)唑殘留量的保留時(shí)間、開始采集時(shí)間和檢測(cè)離子
以峰面積(y) 為縱坐標(biāo),濃度(0.032~0.80 μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析,結(jié)果表明,丙環(huán)唑在0.032~0.80 μg/mL 呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=(1.070 53e+007)x-322 718,r2=0.999 4,見圖1;丙環(huán)唑最小檢出量為2.0×10-3ng。
圖1 丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)曲線
采用GC/MS 單離子掃描方式進(jìn)行定性定量分析,圖2分別為香蕉全蕉、去皮蕉肉和土壤的空白樣品及添加回收樣品GC-MS/SIM色譜圖。
圖2 香蕉全蕉、蕉肉及土壤樣品中丙環(huán)唑的SIM色譜圖
對(duì)不含丙環(huán)唑的香蕉全蕉、去皮蕉肉及土壤樣品,分別添加0.02、0.05、0.5 mg/kg 丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加回收率試驗(yàn),按照1.2.4 和1.2.5 方法提取、凈化;按照1.2.6 和1.2.7 儀器條件進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)添加水平重復(fù)試驗(yàn)5次,同時(shí)做空白對(duì)照;按照2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表2。
表2 香蕉全蕉、蕉肉和土壤樣品中添加丙環(huán)唑的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)
由表2 可知,在香蕉全蕉中3 個(gè)添加水平的平均添加回收率為85%~101%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.4%~3.6%;在去皮蕉肉中3個(gè)添加水平的平均添加回收率為89%~95%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.3%~3.9%;在土壤中3 個(gè)添加水平的平均添加回收率為87%~97%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差5.0%~7.6%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%,最低檢出限為0.02 mg/kg,滿足丙環(huán)唑農(nóng)藥在香蕉中殘留限量的檢測(cè)要求[6]。
按照1.2 方法進(jìn)行施藥并采集樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表3。由表3 可知,丙環(huán)唑在香蕉中的消解半衰期為13.6~19.1 d,在土壤中的半衰期為20.4~21.1 d。可以看出,在香蕉果實(shí)中的半衰期海南低于云南,在香蕉中的降解速率海南大于云南。試驗(yàn)期間海南??跉鉁卦?5~32℃,云南玉溪?dú)鉁卦?2~33℃,海南??谂c云南元江氣溫變化幅度基本相同,而丙環(huán)唑在香蕉果實(shí)中的半衰期是海南海口低于云南元江,分析其原因可能是海南溫度和濕度均高于云南,溫度的升高使農(nóng)藥粘度降低,擴(kuò)散速度加快,更容易被微生物活動(dòng)所利用。
表3 丙環(huán)唑在香蕉和土壤樣品中的消解動(dòng)力學(xué)
根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763-2016)中丙環(huán)唑在植物體內(nèi)的農(nóng)藥殘留物定義為丙環(huán)唑[6],香蕉全果、蕉肉及土壤中丙環(huán)唑最終殘留量結(jié)果見表4??傮w上,丙環(huán)唑在各基質(zhì)中殘留量從小到大依次為蕉肉<全果<土壤,殘留量隨采收間隔時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。丙環(huán)唑在香蕉全果、蕉肉和土壤中的殘留量最大值分別為0.069、0.048 和0.628 mg/kg,在香蕉可食部分中丙環(huán)唑的殘留量遠(yuǎn)低于中國(guó)規(guī)定的MRL值1 mg/kg。表明按照推薦劑量在香蕉上使用11.7%丙環(huán)唑懸浮劑,距最后一次施用后28 d 以上采收,香蕉是安全的。
表4 丙環(huán)唑在香蕉全果、蕉肉與土壤中的最終殘留量
香蕉中含有豐富的水分、糖及淀粉類物質(zhì),采用極性較大的溶劑會(huì)使糖及淀粉類物質(zhì)溶出,影響丙環(huán)唑的提取效果。另外,根據(jù)JMPR 報(bào)告中所述,丙環(huán)唑?yàn)橹苄赞r(nóng)藥,因此本研究選用極性相對(duì)較小的乙腈作為提取溶劑,再通過加入NaCl 的方式,使有機(jī)相和水相分層,糖、淀粉、水溶性色素及其它雜質(zhì)隨水相分離出去,從而達(dá)到初步凈化的效果。采用Strata Florisil SPE 小柱對(duì)香蕉樣品進(jìn)行凈化的過程中,在小柱中添加無水硫酸鈉可去除提取液中殘留的水相,達(dá)到進(jìn)一步去除雜質(zhì)的目的。
本研究建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定香蕉全果、蕉肉及土壤中丙環(huán)唑殘留量的檢測(cè)方法,解決了極性較弱化合物的提取及凈化問題,采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn),解決了質(zhì)譜中香蕉樣品檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)。本方法操作簡(jiǎn)單、節(jié)省溶劑,且方法的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。丙環(huán)唑在海南和云南兩地香蕉中的半衰期分別為13.6 和19.1 d,在土壤中的半衰期分別為20.4 和21.1 d。在海南和云南兩地的最終殘留結(jié)果表明,按推薦劑量和1.5倍推薦劑量,對(duì)香蕉進(jìn)行3 次和4 次噴藥,末次施藥后28、35、42 d 采樣,在香蕉全果、蕉肉及土壤中丙環(huán)唑的殘留量均<1 mg/kg 的限量值。劉燕菁等[7]研究結(jié)果中,廣東省香蕉全果和土壤中丙環(huán)唑的半衰期分別為13.9 和23.3 d,殘留量最高為0.367 mg/kg,本研究結(jié)果與該結(jié)果相近。本研究為保證丙環(huán)唑科學(xué)合理施用,評(píng)價(jià)丙環(huán)唑在香蕉上的安全使用提供了重要參考依據(jù)。