吳 瓊 王明月 呂岱竹 吳曉春 葛會(huì)林

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱作產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(?？?/海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南?？?71101)

丙環(huán)唑是一種既有保護(hù)作用又有治療作用的內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，可被根莖葉部吸收，并很快地在植物體內(nèi)向上傳導(dǎo)。其作用機(jī)理是影響甾醇的生物合成，使病原菌的細(xì)胞膜功能受到破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而起到殺菌、防病和治病的功效。嚴(yán)重的香蕉葉斑病會(huì)影響香蕉的產(chǎn)量和品質(zhì)［1-2］，丙環(huán)唑是防治香蕉葉斑病的主要農(nóng)藥品種之一，在香蕉種植過程中被大量施用［3-5］。經(jīng)查詢中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)，丙環(huán)唑在我國(guó)登記的作物主要有水稻、小麥、玉米、大豆、油菜、馬鈴薯、茭白、蓮藕、枇杷、花生、蘋果、香蕉、榛子和人參等。CAC 標(biāo)準(zhǔn)中制定的香蕉上丙環(huán)唑MRL 為0.1 mg/kg；美國(guó)環(huán)?？偸穑‥PA）制定的MRL 為0.2 mg/kg；歐盟標(biāo)準(zhǔn)中的MRL 為0.1 mg/kg；日本2015 年實(shí)施的“肯定列表制度”對(duì)香蕉中丙環(huán)唑的限量為0.1 mg/kg；中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)香蕉中丙環(huán)唑的MRL為1 mg/kg［6］。

國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的丙環(huán)唑殺菌劑殘留量的檢測(cè)方法有氣相色譜法［7-9］、高效液相色譜法［10］、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法［11-12］等。如：侯志廣等［13］應(yīng)用氣相色譜儀測(cè)定稻米中丙環(huán)唑和咪鮮胺的殘留量；徐妍等［14］應(yīng)用高效液相色譜儀測(cè)定丙環(huán)唑原藥的殘留；葉倩等［15］利用QuEChERS法對(duì)葉菜進(jìn)行前處理，再用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定葉菜中丙環(huán)唑的殘留量。目前，關(guān)于丙環(huán)唑的研究多數(shù)集中在田間藥效和水稻中的殘留分析上，對(duì)于應(yīng)用氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定香蕉及其土壤中的殘留情況目前報(bào)道較少。鑒于此，本研究建立了丙環(huán)唑在香蕉和土壤中殘留及消解動(dòng)態(tài)的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法，并于海南和云南兩地進(jìn)行了田間試驗(yàn)，以期為評(píng)價(jià)丙環(huán)唑在香蕉上的安全使用，確保該藥的科學(xué)合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試作物品種：海南省?？谑?，泰國(guó)蕉；云南省玉溪市，巴西蕉。

（2）試驗(yàn)藥劑：11.7%丙環(huán)唑懸浮劑。

1.1.2 儀器、試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

（1）儀器設(shè)備：控溫控壓全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海豫康科教儀器；氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；固相萃取柱Strata Florisil （55 μm，70 A）。

（2）主要試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：無水硫酸鈉，分析純；乙腈和正己烷均為色譜純；3 mL/500 mg；丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.5%，德國(guó)DR.Ehrensorfer。

1.2 方法

1.2.1 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

按有效成分用藥量375 mg a.i/kg（500 倍液）于香蕉生長(zhǎng)到成熟個(gè)體一半大小時(shí)施藥，施藥時(shí)應(yīng)保證用于動(dòng)態(tài)試驗(yàn)的香蕉均勻著藥，于施藥后2、24、72、168、336、504、672、1008、1440 h

采樣，處理重復(fù)3次，處理間設(shè)保護(hù)隔離區(qū)，另設(shè)清水空白對(duì)照。

1.2.2 最終殘留試驗(yàn)

按推薦劑量有效成分丙環(huán)唑用藥量250 mg a.i/kg（750 倍液），高劑量按有效成分丙環(huán)唑用藥量375 mg a.i/kg（500 倍液）施藥。各設(shè)3 次和4 次施藥，施藥間隔期為10 d，每個(gè)處理重復(fù)3 次，小區(qū)設(shè)3棵樹。采樣時(shí)間距離最后一次噴藥的間隔時(shí)間為28、35、42 d。另設(shè)清水空白對(duì)照，處理間設(shè)保護(hù)帶。

1.2.3 樣品的制備與保存

（1）香蕉全果：田間樣本去凈表面雜質(zhì)，剪去果柄，切段放入搗碎機(jī)，勻漿混勻，用四分法縮分，分取250 g 樣品兩份，分別裝入樣品容器中，貼好實(shí)驗(yàn)室樣號(hào)標(biāo)簽，貯存于-20 ℃冰柜中。

（2）香蕉蕉肉：用刀具縱向?qū)⑾憬肚蟹殖蓛砂辏贸鬃尤〕鼋度夥湃霌v碎機(jī)，勻漿混勻用四分法縮分，分取250 g 樣品兩份，分別裝入樣品容器中，貼好實(shí)驗(yàn)室樣品標(biāo)簽。

（3）土壤：田間樣本過篩混勻后采用四分法留樣500 g 兩份，分別裝入樣品容器中，貼好實(shí)驗(yàn)室樣號(hào)標(biāo)簽，貯存于-20 ℃冰柜中保存。

1.2.4 樣品提取

（1） 香蕉全果及蕉肉樣品：稱取（20.00±0.10）g勻漿后的香蕉樣品，置于50 mL 離心管中，加入40.0 mL 乙腈，高速振蕩5 min 后，加入約6 g NaCl，繼續(xù)高速震蕩5 min，10 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取上清液5.0 mL 于50 mL 圓底燒瓶中，氮吹儀吹干，待凈化。

（2）土壤樣品：稱?。?0.00±0.10）g 已過篩的土壤樣品，置于100 mL塑料瓶中，加入40.0 mL乙腈，10.0 mL水，在往復(fù)式振蕩器上振蕩提取1 h后加入約6 g NaCl，蓋上蓋子，劇烈震蕩5 min，在室溫下靜置不少于30 min，準(zhǔn)確吸取上清液5.0 mL 于50 mL 圓底燒瓶中，氮吹儀吹干，待凈化。

1.2.5 樣品凈化

在Strata Florisil SPE 小柱中加入適量無水硫酸鈉，加樣前先分別用3 mL正己烷/丙酮（V/V＝3/7）和3 mL 正己烷預(yù)洗柱，當(dāng)液面到達(dá)無水硫酸鈉的頂部時(shí)，迅速將1.2.4待凈化提取液轉(zhuǎn)移至凈化柱上，再用3 mL 正己烷/丙酮（V/V＝3/7）洗滌圓底燒瓶3次，并移入柱中洗脫農(nóng)藥，合并于接收瓶中，在40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約0.5 mL，用1.5 mL 正己烷溶劑交換2 次，殘留物用正己烷溶解，準(zhǔn)確至2.5 mL，待上機(jī)。

1.2.6 氣相色譜條件

Thermo Trace Ultra，配Thermo RSH Triplus自動(dòng)進(jìn)樣器，Xcalibur 軟件；色譜柱：HP-5MS，0.25 μm，0.25 mm×30 mm；流速：1.0 mL/min；載氣：氦氣，純度≥99.999 %；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；

程序升溫：100 ℃，保持1 min，20 ℃/min 升至260 ℃，保持4 min，再以40 ℃/min 升至280 ℃，保持10 min；進(jìn)樣方式：無分流進(jìn)樣，3 min后打開閥。

1.2.7 質(zhì)譜條件

Thermo DSQII ；電子轟擊源：70 eV；電子源溫度：250 ℃；GC-MS接口溫度：280 ℃。

1.2.8 分析方法

先用SCAN方式對(duì)丙環(huán)唑進(jìn)行定性，確定其保留時(shí)間（RT）、起始采集時(shí)間和定量離子，見表1。

用正己烷配制100 μg/mL 丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)母液，并用空白基質(zhì)逐級(jí)稀釋成0.8、0.16、0.08、0.064、0.032 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析，外標(biāo)法定量。

表1 GC-MS/SIM分析丙環(huán)唑殘留量的保留時(shí)間、開始采集時(shí)間和檢測(cè)離子

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及儀器檢出限

以峰面積（y） 為縱坐標(biāo)，濃度（0.032～0.80 μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明，丙環(huán)唑在0.032～0.80 μg/mL 呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝（1.070 53e+007）x-322 718，r2＝0.999 4，見圖1；丙環(huán)唑最小檢出量為2.0×10-3ng。

圖1 丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 質(zhì)譜條件的設(shè)定

采用GC/MS 單離子掃描方式進(jìn)行定性定量分析，圖2分別為香蕉全蕉、去皮蕉肉和土壤的空白樣品及添加回收樣品GC-MS/SIM色譜圖。

圖2 香蕉全蕉、蕉肉及土壤樣品中丙環(huán)唑的SIM色譜圖

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

對(duì)不含丙環(huán)唑的香蕉全蕉、去皮蕉肉及土壤樣品，分別添加0.02、0.05、0.5 mg/kg 丙環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，按照1.2.4 和1.2.5 方法提取、凈化；按照1.2.6 和1.2.7 儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)添加水平重復(fù)試驗(yàn)5次，同時(shí)做空白對(duì)照；按照2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。

表2 香蕉全蕉、蕉肉和土壤樣品中添加丙環(huán)唑的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

由表2 可知，在香蕉全蕉中3 個(gè)添加水平的平均添加回收率為85%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.4%～3.6%；在去皮蕉肉中3個(gè)添加水平的平均添加回收率為89%～95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.3%～3.9%；在土壤中3 個(gè)添加水平的平均添加回收率為87%～97%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差5.0%～7.6%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%，最低檢出限為0.02 mg/kg，滿足丙環(huán)唑農(nóng)藥在香蕉中殘留限量的檢測(cè)要求［6］。

2.4 丙環(huán)唑在香蕉全果及土壤中的消解動(dòng)態(tài)

按照1.2 方法進(jìn)行施藥并采集樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。由表3 可知，丙環(huán)唑在香蕉中的消解半衰期為13.6～19.1 d，在土壤中的半衰期為20.4～21.1 d。可以看出，在香蕉果實(shí)中的半衰期海南低于云南，在香蕉中的降解速率海南大于云南。試驗(yàn)期間海南?？跉鉁卦?5～32℃，云南玉溪?dú)鉁卦?2～33℃，海南?？谂c云南元江氣溫變化幅度基本相同，而丙環(huán)唑在香蕉果實(shí)中的半衰期是海南海口低于云南元江，分析其原因可能是海南溫度和濕度均高于云南，溫度的升高使農(nóng)藥粘度降低，擴(kuò)散速度加快，更容易被微生物活動(dòng)所利用。

2.5 丙環(huán)唑在香蕉全果、蕉肉及土壤中的最終殘留量

表3 丙環(huán)唑在香蕉和土壤樣品中的消解動(dòng)力學(xué)

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2016）中丙環(huán)唑在植物體內(nèi)的農(nóng)藥殘留物定義為丙環(huán)唑［6］，香蕉全果、蕉肉及土壤中丙環(huán)唑最終殘留量結(jié)果見表4?？傮w上，丙環(huán)唑在各基質(zhì)中殘留量從小到大依次為蕉肉＜全果＜土壤，殘留量隨采收間隔時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。丙環(huán)唑在香蕉全果、蕉肉和土壤中的殘留量最大值分別為0.069、0.048 和0.628 mg/kg，在香蕉可食部分中丙環(huán)唑的殘留量遠(yuǎn)低于中國(guó)規(guī)定的MRL值1 mg/kg。表明按照推薦劑量在香蕉上使用11.7%丙環(huán)唑懸浮劑，距最后一次施用后28 d 以上采收，香蕉是安全的。

表4 丙環(huán)唑在香蕉全果、蕉肉與土壤中的最終殘留量

3 小結(jié)

香蕉中含有豐富的水分、糖及淀粉類物質(zhì)，采用極性較大的溶劑會(huì)使糖及淀粉類物質(zhì)溶出，影響丙環(huán)唑的提取效果。另外，根據(jù)JMPR 報(bào)告中所述，丙環(huán)唑?yàn)橹苄赞r(nóng)藥，因此本研究選用極性相對(duì)較小的乙腈作為提取溶劑，再通過加入NaCl 的方式，使有機(jī)相和水相分層，糖、淀粉、水溶性色素及其它雜質(zhì)隨水相分離出去，從而達(dá)到初步凈化的效果。采用Strata Florisil SPE 小柱對(duì)香蕉樣品進(jìn)行凈化的過程中，在小柱中添加無水硫酸鈉可去除提取液中殘留的水相，達(dá)到進(jìn)一步去除雜質(zhì)的目的。

本研究建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定香蕉全果、蕉肉及土壤中丙環(huán)唑殘留量的檢測(cè)方法，解決了極性較弱化合物的提取及凈化問題，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)，解決了質(zhì)譜中香蕉樣品檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)。本方法操作簡(jiǎn)單、節(jié)省溶劑，且方法的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。丙環(huán)唑在海南和云南兩地香蕉中的半衰期分別為13.6 和19.1 d，在土壤中的半衰期分別為20.4 和21.1 d。在海南和云南兩地的最終殘留結(jié)果表明，按推薦劑量和1.5倍推薦劑量，對(duì)香蕉進(jìn)行3 次和4 次噴藥，末次施藥后28、35、42 d 采樣，在香蕉全果、蕉肉及土壤中丙環(huán)唑的殘留量均＜1 mg/kg 的限量值。劉燕菁等［7］研究結(jié)果中，廣東省香蕉全果和土壤中丙環(huán)唑的半衰期分別為13.9 和23.3 d，殘留量最高為0.367 mg/kg，本研究結(jié)果與該結(jié)果相近。本研究為保證丙環(huán)唑科學(xué)合理施用，評(píng)價(jià)丙環(huán)唑在香蕉上的安全使用提供了重要參考依據(jù)。