楊宇軒 張海霞 王爽

西安交通大學口腔醫(yī)院正畸科 西安 710004

牙周炎是發(fā)生在牙周組織，在牙石等多種局部因素刺激下，以牙齦炎癥、牙槽骨吸收、牙周袋形成、牙齒松動為主要表現的一類疾病，其牙槽骨破壞呈現不可逆性[1]。臨床上對于牙槽骨吸收的主要治療方式有引導組織再生術（guided tissue regeneration，GTR）、牙周植骨術、生長因子治療等[2]。傳統(tǒng)的治療牙槽骨缺損的方法存在費用高、干細胞來源缺乏以及干細胞移植的倫理問題[3]、遠期效果不確定[4]等限制，臨床治療效果并不理想。目前研究表明，釉基質蛋白具有在牙周缺損區(qū)誘導形成與牙本質緊密結合的無細胞牙骨質、恢復牙周纖維附著、促進牙周再生的作用[5]，是現有治療手段的有效補充，但是其具體促進牙周再生的機制仍待研究。

牙周組織的再生涉及細胞遷移、細胞黏附、細胞增殖等多種生物學行為，在這些過程中，釉原蛋白均起到一定的調節(jié)作用。因組織來源和細胞種類不同，釉原蛋白的調節(jié)作用也不盡相同，這些調控作用可以有效調控牙周組織缺損時優(yōu)先附著和增殖的細胞，具有重要的臨床意義。

1 對細胞遷移的調控

1.1 牙周膜成纖維細胞

牙周膜成纖維細胞（periodontal ligament fi-broblasts）是人牙周膜中數量最多、具有重要功能的一種細胞，具有獨特且高效的合成細胞外基質中膠原蛋白的能力，是形成牙周膜纖維的主要細胞[6]。牙周膜成纖維細胞可以分化成為成骨細胞樣和成牙骨質細胞樣細胞，并且被認為在維持和修復牙周組織中起到重要作用[7]。

重組豬釉原蛋白（recombinant porcine amelogenin）作用于原代培養(yǎng)的牙周膜成纖維細胞，可以明顯促進牙周膜成纖維細胞的遷移。在無血清培養(yǎng)基中，添加重組豬釉原蛋白，培養(yǎng)牙周膜成纖維細胞，在細胞貼壁生長后，使用毛細管尖端在細胞匯合處制造無細胞劃痕，隨后48 h內每12 h觀察細胞遷移情況，結果顯示與對照組相比，牙周膜成纖維細胞的遷移速率顯著增加[8]。還有實驗[9]表明，在釉原蛋白作用下，牙周膜成纖維細胞通過boyden小室的速率較對照組顯著提高，顯示釉原蛋白對牙周膜成纖維細胞遷移具有促進作用。

1.2 牙齦上皮細胞和牙齦成纖維細胞

牙齦是牙周組織的另一組成成分，其主要由牙齦上皮細胞（gingival epithelial cell）組成。由于牙齦上皮細胞生長迅速，在牙周組織受損后會搶先遷移至受損的牙槽骨表面，形成上皮附著，阻礙牙周組織的再生[10]。

重組豬釉原蛋白處理后的牙齦上皮細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，使用毛細管尖端在細胞匯合處制造無細胞劃痕，結果顯示，與對照組相比，24 h后牙齦上皮細胞的遷移速率出現了明顯下降[8]。同時，在重組豬釉原蛋白干預下，6 h后牙齦成纖維細胞的遷移速率也出現明顯下降。

1.3 牙周膜干細胞

牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cell）是存在于牙周膜中的一種未分化的間充質干細胞，具有自我更新及多向分化潛能，在一定條件下能夠定向分化為成牙骨質樣細胞、成纖維細胞和脂肪細胞。在免疫缺陷小鼠體內，牙周膜干細胞可以產生牙骨質、牙周膜樣結構，是維持牙周組織穩(wěn)態(tài)，促進牙周組織再生的重要種子細胞[11]。

釉原蛋白可以促進干細胞遷移。在劃痕實驗中，實驗組以人全長重組釉原蛋白GST-rMI80處理體外培養(yǎng)牙周膜干細胞，并在12和24 h觀察其遷移情況。實驗[12]結果顯示，GST-rMI80處理的牙周膜干細胞的遷移速率顯著高于對照組。

1.4 可能的機制

研究[13]顯示，細胞膜表面蛋白Grp78可能是釉原蛋白的受體，其可以促使釉原蛋白進入細胞內發(fā)揮其促進細胞遷移作用。Toyoda等[12]研究發(fā)現，釉原蛋白可以與細胞膜表面葡萄糖調節(jié)蛋白Grp78特異性結合，激光共聚焦顯微鏡顯示，這種聯結蛋白會誘導細胞的內吞作用，沉默Grp78基因可以抑制其內吞作用（圖1）。

圖1 Grp78介導的細胞內吞作用Fig 1 Grp78 mediated endocytosis

進一步研究顯示，釉原蛋白可以調節(jié)細胞遷移相關基因的表達。在受到釉原蛋白作用時，Grp78過表達的細胞的遷移作用會顯著增強，同時不影響其對于細胞增殖的調節(jié)作用。沉默Grp78基因會消除釉原蛋白對細胞遷移的促進作用。

2 對細胞增殖的調控

2.1 牙周膜成纖維細胞和牙齦成纖維細胞

一項系統(tǒng)回顧[14]顯示，釉原蛋白干預的牙周膜成纖維細胞和牙齦成纖維細胞的增殖速率較對照組明顯增加，細胞內DNA合成明顯增強，并且促進作用具有濃度依賴性。另有研究[8]以重組豬釉原蛋白處理牙周膜成纖維細胞和牙齦成纖維細胞，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后進行細胞計數，實驗結果顯示，重組豬釉原蛋白可以顯著促進牙周膜成纖維細胞和牙齦成纖維細胞的增殖，其促進效果在重組豬釉原蛋白濃度為10 μg·mL-1時具有時間依賴性。

2.2 牙齦上皮細胞

使用重組豬釉原蛋白處理實驗組牙齦上皮細胞，細胞計數結果顯示，與成纖維細胞相反，重組豬釉原蛋白顯著抑制了牙齦上皮細胞的增殖[8]。

2.3 牙周膜干細胞

Kémoun等[15]研究發(fā)現，釉原蛋白可以顯著促進牙周膜干細胞增殖。Cheng等[16]使用人全長重組釉原蛋白和豬釉基質蛋白處理牙周膜干細胞，在隨后8 d內對細胞進行計數。實驗結果顯示，人全長重組釉原蛋白和豬釉基質蛋白在干預后前3 d均能夠顯著增強牙周膜干細胞的增殖，在實驗觀察的8 d中，其促進增殖的效果始終存在，并在第6 d達到最高值。

2.4 可能的機制

有研究[17]顯示，釉原蛋白誘導的細胞增殖與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）/細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路密切相關。MAPK是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK/ERK通路存在于大多數細胞內，能夠將細胞外信號轉導至細胞以及細胞核內，引起多種生物學作用[18]。研究[19]表明，重組全長人釉原蛋白作用于人骨髓間充質干細胞時，可以顯著增強人骨髓間充質干細胞的增殖，MAPK通路阻滯劑U0126可以顯著抑制其促進增殖的作用。Yoshimi等[17]研究顯示，重組釉原蛋白作用下的人成牙骨質細胞內ERK1/2磷酸化顯著增強，MARK抑制劑可以阻斷這一反應。

3 對細胞黏附的調控

3.1 牙周膜成纖維細胞和牙齦成纖維細胞

釉原蛋白可以促進牙周膜成纖維細胞和牙齦成纖維細胞的細胞黏附作用。有研究[8]使用重組豬釉原蛋白處理牙周膜成纖維細胞和牙齦成纖維細胞，對黏附細胞用胰酶消化后進行細胞計數，結果顯示，重組豬釉原蛋白在牙周膜成纖維細胞和牙齦成纖維細胞生長的前30 min可以顯著促進細胞黏附；但隨著時間的延長，這種對細胞黏附的促進作用會逐漸下降，在干預4 h后，重組豬釉原蛋白對細胞黏附的促進作用幾乎消失。

3.2 牙齦上皮細胞

有研究[8]顯示，重組豬釉原蛋白能夠顯著抑制牙齦上皮細胞的黏附。另有研究[20]指出，釉原蛋白對牙齦上皮細胞黏附的抑制作用具有濃度和時間依賴性，釉原蛋白濃度越高，作用時間越長，對牙齦上皮細胞黏附的抑制作用越強。

3.3 牙周膜干細胞

釉原蛋白在一定時間內可以促進牙周膜干細胞的細胞黏附。使用重組人全長釉原蛋白和豬釉原蛋白分別處理牙周膜干細胞，隨后對黏附細胞進行計數，實驗結果顯示接種2 h后，牙周膜干細胞的黏附率達到80%左右；重組人全長釉原蛋白和豬釉原蛋白均能夠在細胞接種的前60 min顯著提高牙周膜干細胞的黏附率，但在60 min之后對細胞黏附的影響與對照組沒有顯著性差異[16]。

3.4 可能的機制

目前對于釉原蛋白對細胞黏附影響的機制了解較少。Toyoda等[12]發(fā)現，沉默Grp78基因后，釉原蛋白誘導的細胞黏附也隨之消失，并認為Grp78在釉原蛋白誘導細胞黏附方面具有重要作用。

4 對細胞分化的調控

釉原蛋白在具有調節(jié)細胞遷移、黏附、增殖作用的同時，還顯示出具有誘導牙周組織細胞成骨分化的作用。在釉原蛋白的誘導下，成牙骨質細胞、間充質干細胞、牙周膜細胞等都會表達成骨相關蛋白質，并產生鈣化結節(jié)，對牙周組織再生具有重要意義。

4.1 間充質干細胞

牙周組織的牙周膜干細胞和骨髓間充質干細胞均屬于間充質干細胞，在體外培養(yǎng)中，釉原蛋白可以誘導其產生鈣化結節(jié)，并分化成為成骨細胞，這是牙周組織再生的關鍵環(huán)節(jié)。研究[21]顯示，在含有重組釉原蛋白片段的培養(yǎng)液中培養(yǎng)間充質干細胞，其堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）的表達水平顯著上升。同時，在成骨環(huán)境中，重組釉原蛋白還可以增強堿性磷酸酶的活性，其最大濃度和最大活性都顯著高于對照組。

在成骨環(huán)境中，重組釉原蛋白片段還可以促進Ⅰ型原骨膠原和骨鈣蛋白的表達。實驗[22]結果顯示，在含有重組釉原蛋白片段的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質干細胞，其第7和14 d的Ⅰ型原骨膠原和骨鈣蛋白的表達量都顯著高于對照組。

釉原蛋白對間充質干細胞的成骨分化誘導作用具有濃度依賴性。在誘導牙齦間充質干細胞的實驗[23]中，100 μg·mL-1的釉原蛋白在成骨誘導后1～2周就可以檢測到染色的鈣化結節(jié)；而25 μg·mL-1的釉原蛋白誘導時，則至少需要3～4周才可觀察到。在25和100 μg·mL-1釉原蛋白干預的牙齦間充質干細胞中，堿性磷酸酶mRNA的表達量都明顯提高。

綜上，不同生物來源的釉原蛋白均具有促進間充質干細胞成骨分化的能力，并且這種促進能力具有濃度依賴性。

4.2 成牙骨質細胞

成牙骨質細胞是牙骨質細胞間質內一類可以分泌鈣化基質和膠原纖維的細胞，其與牙根表面平行，是連接牙周膜和牙骨質的組成部分。茜素紅染色顯示，釉原蛋白可以顯著增加成牙骨質細胞分泌的鈣化基質，聚合酶鏈式反應顯示，在釉原蛋白作用下，成牙骨質細胞中的堿性磷酸酶、骨涎蛋白、骨鈣蛋白的表達明顯增加，具有促進成牙骨質細胞成骨分化的作用[24]。

4.3 牙周膜干細胞

釉原蛋白可以顯著增加牙周膜干細胞的堿性磷酸酶表達量，并具有濃度依賴性。加入釉原蛋白抗體可以有效地抑制這種促進作用。加入抗體后，牙周膜干細胞的堿性磷酸酶表達量與對照組沒有顯著性差異。實驗[25]結果顯示，釉原蛋白可以促進牙周膜干細胞發(fā)生成骨分化。

4.4 可能機制

Olivares-Navarrete等[21]研究顯示，釉原蛋白作用于人間充質干細胞，在使其發(fā)生成骨分化的過程中，蛋白激酶C、ERK1/2、β-連環(huán)蛋白發(fā)生了高度磷酸化；進一步研究顯示，ERK1/2的抑制劑可以阻斷細胞合成堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2等成骨相關蛋白質。因此，釉原蛋白誘導的細胞分化作用與ERK通路、蛋白激酶C和β-連環(huán)蛋白的降解密切相關（圖2）。

圖2 Wnt/β-連環(huán)蛋白通路示意圖Fig 2 Wnt/β-catenin pathway

重組釉原蛋白誘導細胞發(fā)生成骨分化的過程與Wnt/β-連環(huán)蛋白通路密切相關。Wnt/β-連環(huán)蛋白通路在胚胎發(fā)育和成熟機體中均具有重要意義，同時還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，對維持同型細胞的黏附、防止細胞的移動發(fā)揮作用。

經典的Wnt/β-連環(huán)蛋白通路作用方式是：Wnt分子與細胞膜表面特異性受體Frizzled結合，進而使β-連環(huán)蛋白在細胞內的濃度升高。隨后β-連環(huán)蛋白向細胞核內轉移，引起細胞的增殖、分化、成熟[26]。有研究[27]表明，在釉原蛋白處理的胚胎干細胞中，β-連環(huán)蛋白的表達量顯著上升，Wnt的細胞膜表面受體的表達量也明顯上調。同時，應用特異性Wnt抑制劑sFRP-1可完全阻斷釉原蛋白介導的胚胎干細胞成骨分化作用。

5 問題與展望

以往的研究證實，釉基質蛋白可以誘導牙周組織的再生。釉原蛋白是釉基質蛋白的主要組成成分，占釉基質蛋白的90%以上，是釉基質蛋白發(fā)揮牙周再生作用的主要成分[5]。在牙周組織再生過程中，釉原蛋白在細胞遷移、細胞增殖、細胞黏附、細胞分化等過程中發(fā)揮著不同的生物學作用。通過基因芯片分析發(fā)現，釉原蛋白作用過程中表達發(fā)生變化的基因涵蓋信號轉導、轉錄、翻譯、細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡、免疫應答、囊泡運輸、溶酶體活動，以及細胞骨架、細胞黏附和產生細胞外基質等方面[28]。同時，由于牙周組織的復雜性，在牙周組織發(fā)生缺損時，搶先黏附于缺損骨組織表面的細胞可以決定牙周組織愈合的性質[10]，所以調節(jié)細胞遷移和黏附在牙周組織缺損的重建中具有重要的臨床意義。釉原蛋白的作用具有細胞特異性，可以抑制牙齦上皮細胞的遷移，促進間充質干細胞、牙周膜成纖維細胞的遷移和增殖，從而有效促進骨組織和牙周膜的再生，誘導牙周缺損的重建，是理想的治療牙周組織缺損并促進牙周組織再生的藥物。

目前，對釉原蛋白的生物學作用研究較多，從不同細胞來源、不同種屬和不同作用方式等方面進行了闡述，同時在牙周組織之外的領域也得到了一定的臨床應用[29]。目前認為，在牙周組織再生過程中，釉原蛋白對葡萄糖調節(jié)蛋白Grp78[12]、MAPK/ERK通路[19]和Wnt/β-連環(huán)蛋白通路[27]發(fā)揮著重要生物學作用。但是，已有的研究對于釉原蛋白在誘導牙周組織再生的過程中的具體作用方式仍不明確，還需要從以下幾個方面進一步探究釉原蛋白生物學效應的機制。

1）釉原蛋白與效應細胞的具體結合位點仍不明確，對如何激活信號通路、與細胞膜表面哪些受體結合而產生生物學效應仍有待研究。

2）對不同通路之間是否存在潛在的聯系仍有待研究。

3）由于釉原蛋白是一種復合型蛋白質，可被分為不同大小的片段，目前部分研究使用全長重組釉原蛋白，也有使用不同大小重組釉原蛋白片段進行的研究，尚沒有研究探討釉原蛋白能夠發(fā)揮最佳生物學效應的最小片段的分子質量。