方健文，袁 晴，邵 毅

0引言

角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)是一種在炎癥、缺氧、創(chuàng)傷或角膜緣干細(xì)胞缺損情況下發(fā)生的病理狀態(tài)[1]。正常的角膜是無血管的，在某些情況下，毛細(xì)血管或淋巴管侵入角膜后會產(chǎn)生CNV[2]。角膜的透明程度對于視力十分重要。CNV的產(chǎn)生使得過多的血管從結(jié)膜向角膜生長，可能導(dǎo)致視力障礙，甚至失明，是一種常見的疾病后遺癥[3]。CNV可以通過新型抗血管生成療法治療，盡管目前治療效果仍不理想[4]，但是通過在動物模型中進行參數(shù)對比和機制研究，同時進行組織學(xué)比較及藥物治療等研究將會為CNV的治療帶來新的方向。

1 CNV的形成機制

CNV的形成機制涉及炎性介質(zhì)、細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)之間的相互作用，是一個相互調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程[5]。正常情況下，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白在角膜上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和角膜緣血管內(nèi)皮細(xì)胞中基礎(chǔ)性表達，被內(nèi)源性表達的可溶性VEGF受體隔離，以維持角膜無血管的狀態(tài)及其良好的透明度[5]。在眼前段炎癥、創(chuàng)傷和缺血等病理情況下，或是在角膜水腫、角膜瘢痕、脂質(zhì)沉積、角膜移植等其他情況下，VEGF誘導(dǎo)CNV發(fā)生[6]。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)通過誘導(dǎo)CNV的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生尿激酶型纖溶酶原激活劑，使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，纖溶酶激活膠原酶，溶解血管的基底膜，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞移行，從而促進CNV生長[7]。CNV的形成還可能與缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)相關(guān)[8]。缺氧狀態(tài)下，缺氧誘導(dǎo)因子-1α活性增強調(diào)控VEGF基因表達[9]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，能夠使細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜水解[10]?；|(zhì)金屬蛋白酶與CNV的發(fā)生密切相關(guān)，通過抑制MMP-2和MMP-9的表達，新生血管的生長受到明顯抑制[11]。

2 CNV動物模型制備方法

目前建立的CNV模型有家兔模型和老鼠模型，家兔在研究人類角膜疾病方面具有多方面的優(yōu)勢[12]：(1)家兔眼球相對較大，方便手術(shù)操作和觀察；(2)實驗中可以同時對同一家兔的左右眼進行對照實驗，避免個體差異；(3)家兔眼角膜與人類角膜解剖結(jié)構(gòu)相似等。

建立CNV模型的方法有：縫線法、熱燒灼法、化學(xué)燒傷法，以及角膜囊袋法，如VEGF緩釋藥丸誘導(dǎo)法、bFGF緩釋藥丸誘導(dǎo)法和內(nèi)毒素緩釋聚合物誘導(dǎo)法等?？p線法損傷角膜上皮和基底細(xì)胞，一方面會引起角膜微環(huán)境缺氧，觸發(fā)VEGF的表達，另一方面炎癥細(xì)胞浸潤產(chǎn)生大量促新生血管生長因子，使VEGF高表達[13]。熱燒灼法主要是通過熱損傷角膜引起局部的前列腺素合成增加，持續(xù)產(chǎn)生促血管生成因子，使白細(xì)胞浸潤和新生血管增生[14]。這些基于損傷制作的CNV模型被廣泛地應(yīng)用，具有操作簡單、成本低等優(yōu)點。其缺點是容易造成其他非血管因素影響，如角膜穿孔、上皮增生等。

角膜囊袋法是通過將包含促血管生成因子的藥丸聚合物植入角膜，藥物的緩慢釋放誘導(dǎo)血管生成[15]。金玲等[16]分別將7.5%、15%和30% 3種濃度內(nèi)毒素緩釋聚合物植入兔角膜基質(zhì)層，觀察到7.5%內(nèi)毒素藥膜誘導(dǎo)產(chǎn)生的新生血管生長稀疏、速度緩慢、范圍較小，達不到建立模型的要求；植入30%內(nèi)毒素藥膜，角膜局部水腫反應(yīng)嚴(yán)重，新生血管粗亂且密集生長，不利于觀察及定量分析；15%內(nèi)毒素藥膜誘導(dǎo)產(chǎn)生的CNV生長規(guī)律、密度均勻、血管清晰、角膜水腫輕，便于連續(xù)、動態(tài)地觀察和分析。結(jié)果表明內(nèi)毒素能夠誘導(dǎo)CNV的生成并呈現(xiàn)出劑量依賴型，可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)毒素濃度制作不同的模型，來滿足各種實驗研究需要。

此外，還可以通過角膜移植[17]、角膜基質(zhì)內(nèi)注射牛白蛋白[18]等方法制作免疫原性CNV模型。該種模型高度模擬了臨床環(huán)境中的CNV病程，是研究角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)的理想模型。

3轉(zhuǎn)基因老鼠模型在研究CNV中的應(yīng)用

CNV的轉(zhuǎn)基因老鼠模型可以不需要任何其他的實驗操作干涉，可以用來研究不同的相互關(guān)聯(lián)的促血管生成信號級聯(lián)反應(yīng)。近年來，基因工程老鼠的研究進展激發(fā)了對自發(fā)性CNV的研究。

Niederkorn等[19]發(fā)現(xiàn)，無胸腺裸鼠(nu/nu)的角膜上皮下會長出新生血管，而重度聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immune deficiency，SCID)小鼠的角膜是無血管的，說明角膜血管的存在與裸鼠的免疫缺陷狀態(tài)無關(guān)，然而在無毛的突變老鼠株(SKH1；hr/hr)中發(fā)現(xiàn)了與裸鼠相似的角膜血管化。裸鼠這種自發(fā)性CNV可能是由于血管生成因子與抗血管生成因子之間的局部失衡所致[20]。

3.1與VEGF信號通路相關(guān)的CNV轉(zhuǎn)基因鼠Corn1小鼠缺失細(xì)胞骨架蛋白destrin的編碼基因，表現(xiàn)出早發(fā)性、自發(fā)性CNV和新生淋巴管，新生血管和淋巴管可以通過阻斷VEGF-VEGFR-3信號減少：通過外部應(yīng)用抗VEGFR-3抗體或sVEGFR-1[21]。CNV在出生后4wk達到100%患病率，12mo內(nèi)未見消退，而角膜新生淋巴管患病率不完全(3mo達到60%，12mo下降至約15%)。值得注意的是，該模型顯示低炎癥形式的血管生成。以角膜切片CD45陽性細(xì)胞數(shù)量來衡量炎癥活性，Corn1角膜炎癥活性明顯低于同種異體角膜移植后角膜炎癥活性。雖然應(yīng)用抗VEGFR-3抗體后CNV部分消退，但仍存在一定程度的病理新生血管。Corn1表型發(fā)病早，外顯率高，非常適合用于新生血管的研究，可用于評估已知或未知的抗血管生成藥物。

角膜表達的可溶性VEGF受體-1[22](soluble VEGF receptor-1，sVEGFR-1)和可溶性VEGF受體-2[23](soluble VEGF receptor-2，sVEGFR-2)分別能抑制血管生成和淋巴管生成。在對它們的研究中發(fā)現(xiàn)，pCre/VEGFR1loxP/loxP和LeCre/VEGFR-2loxP/loxP小鼠模型缺少這些可溶性受體的表達，從而會自發(fā)地出現(xiàn)新生血管和淋巴管。

連接黏附分子A(junctional adhesion molecule A，JAM-A)是一種與調(diào)節(jié)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管發(fā)生與血小板聚集相關(guān)的緊密連接蛋白[24]。JAM-A缺陷小鼠表現(xiàn)出自發(fā)性CNV、炎癥和混濁[25]。這些變化與多種促炎和促血管生成系統(tǒng)的激活有關(guān)，其中包括TGF-b通路和VEGF-A-VEGFR-2通路。盡管JAM-A-/-小鼠模型的表型在實際應(yīng)用中是不完全外顯性的，在對新生血管的研究中該模型還是非常具有潛力。

3.2與非VEGF信號通路相關(guān)的CNV轉(zhuǎn)基因鼠BTB-Kelch(bric-a-brac，tramtrack and broad complex，BTB-Kelch)蛋白KLEIP(kelch-like ECT2 interacting protein，KLEIP)是調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和細(xì)胞間連接形成的重要分子[26]。為了研究KLEIP對小鼠眼睛的作用，Hahn等[27]制作了KLEIP-/-小鼠模型，出生時KLEIP-/-小鼠與KLEIP+/+小鼠的角膜無明顯區(qū)別，眼瞼開放后KLEIP-/-小鼠開始出現(xiàn)上皮增生、進行性角膜營養(yǎng)不良，最終導(dǎo)致角膜混濁，伴有自發(fā)性基質(zhì)血管化。Kather等[28]阻斷KLEIP-/-小鼠的VEGF信號并不能減少小鼠角膜血管和淋巴管的生長，說明該模型可以用來評估非VEGF靶向藥對新生血管的治療效果。KLEIP-/-小鼠的CNV與營養(yǎng)不良的角膜中存在巨噬細(xì)胞有關(guān)，但目前尚不清楚該模型中血管生成和(或)淋巴管生成是否需要這些巨噬細(xì)胞。在實踐中，由于KLEIP-/-CNV具有高外顯率，且表型進展的時間進程具有良好的特征，因此非常適合用于血管生成研究。

3.3與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的CNV轉(zhuǎn)基因鼠cAMP應(yīng)答原件結(jié)合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein，CBP/p300)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CBP/p300反式作用因子(CBP/p300-interacting transactivators with glutamic acid (E) and aspartic acid (D)-rich tail 2，Cited2)在成年老鼠角膜中較高表達，提示Cited2可能與角膜成熟和維持有關(guān)[29]。為了研究Cited2在角膜中的作用，Chen等[30]通過將Cited2-floxed小鼠與Le-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，建立了表面外胚層衍生的眼部結(jié)構(gòu)(包括角膜)中Cited2缺失的小鼠模型，表現(xiàn)為角膜混濁和自發(fā)性CNV。該模型有助于研究角膜中涉及的分子機制，還可以用來評估角膜疾病的治療方案。

人類配對盒基因Pax6(paired-box gene 6，Pax6)是脊椎動物和無脊椎動物眼睛發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[31]。Davis等[32]通過將醛脫氫酶3a1(aldehyde dehydrogenase 3a1，Aldh3a1)啟動子融合到Pax6基因的編碼區(qū)制作了Pax6過表達轉(zhuǎn)基因小鼠模型，表現(xiàn)出角膜上皮異常和炎癥性基質(zhì)新生血管。Pax6+/-雜合子小鼠則表現(xiàn)出相似的角膜血管化特征[33]。但是在對血管生成的實際研究中，Pax6+/-小鼠并不完全適合：表型出現(xiàn)早在出生后2wk，但是外顯率是不完整的。在Pax6過表達小鼠中，新生血管表型的患病率因遺傳背景的不同而不同，通常低于70%。為了建立標(biāo)準(zhǔn)的CNV模型，可以對這種小鼠經(jīng)行育種優(yōu)化。

叉頭框轉(zhuǎn)錄因子FoxC1(forkhead box transcription factor C1，F(xiàn)oxC1)是一種參與調(diào)控角膜血管生長的重要因子，Seo等[34]建立的FoxC1-/-小鼠模型和神經(jīng)嵴(neural crest，NC)特異性敲除NC-FoxC1-/-小鼠模型表現(xiàn)出自發(fā)性角膜血管和淋巴管過度生長；雜合子FoxC1+/-小鼠模型和NC-FoxC1+/-小鼠模型則表現(xiàn)出相對溫和的表型如角膜緣血管受損，而且在角膜損傷情況下，血管和淋巴管相較于對照組明顯增多。該類模型的機制與MMP和sVEGFR-1密切相關(guān)[35]。對血管生成的研究中，這個模型非常具有吸引力，因為它以兩種方式簡化了實驗過程。首先，在這些小鼠中，CNV在出生時就存在；其次，雜合子小鼠也可以用于研究，這使得每窩產(chǎn)仔的生物樣本量增加了兩倍。

T細(xì)胞特異性表達組成性活性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄活化因子6(signal transducer and activator of transcription factor 6，Stat6)的轉(zhuǎn)基因小鼠是研究急性和慢性特應(yīng)性皮炎的模型[36]。Conwell等[37]報道該模型表現(xiàn)出CNV。

3.4與自發(fā)性角膜腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)基因鼠RAS-絲裂原活化激酶(RAS-mitogen activated kinase，RAS-MAPK)信號傳導(dǎo)是影響細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞周期等細(xì)胞過程的多種生長因子和細(xì)胞外信號傳遞的主要途徑[38]。這一途徑的關(guān)鍵效應(yīng)激酶是細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(extracellular signal-regulated kinases 1 and 2，ERK1/2)，它們被絲裂原激酶激酶1(mitogen kinase kinase 1，MEK1)激活[38]。Bargagna-Mohan等[39]報道了ERK1/2在轉(zhuǎn)基因小鼠Schwann細(xì)胞中活性升高，表現(xiàn)出CNV和自發(fā)性角膜神經(jīng)纖維瘤，CNV的產(chǎn)生與入侵角膜中央的肥大細(xì)胞有關(guān)，這是對轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)形成角膜腫瘤的首次報道。

3.5其他相關(guān)性CNV轉(zhuǎn)基因鼠富亮氨酸重復(fù)序列免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(protein leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1，LRIG1)是角膜上皮角膜緣干細(xì)胞和眼上皮基底細(xì)胞的標(biāo)志物，LRIG1的敲除會導(dǎo)致自發(fā)性角膜上皮異型增生及基質(zhì)的CNV[40]。LRIG1是促炎癥的Stat3通路的負(fù)性調(diào)控因子，而在LRIG1-/-小鼠中抑制Stat3可以抑制該病理表型，防止角膜混濁。表達組成性活性Stat3的K5.Stat3C轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出相似的表型，包括角膜混濁和新生血管[40]。LRIG1-/-小鼠模型和K5.Stat3C轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以用來研究自發(fā)性炎癥性CNV的機制。

4轉(zhuǎn)基因模型的優(yōu)勢和局限性

在轉(zhuǎn)基因鼠模型中，角膜基質(zhì)新生血管常與角膜上皮結(jié)構(gòu)紊亂和角膜上皮向皮膚樣上皮轉(zhuǎn)化有關(guān)，例如，在LRIG1-/-、KLEIP-/-、Pax6+/-和Corn1小鼠中[21,28,40-41]。在小鼠模型中，導(dǎo)致角膜上皮結(jié)構(gòu)改變的兩個病因是角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells，LSC)缺乏和上皮細(xì)胞增殖紊亂[42-43]。LSC缺失、角膜上皮發(fā)育不良和基質(zhì)新生血管在LRIG1缺失的小鼠中被觀察到，LRIG1是一種中度特異性的LSC標(biāo)記物和炎癥調(diào)節(jié)因子[40]。此外，角膜上皮細(xì)胞增殖能力與肌動蛋白細(xì)胞骨架的功能相關(guān)，例如Corn1中的角膜上皮營養(yǎng)不良是由于細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)受損所致[43]。KLEIP蛋白也與肌動蛋白細(xì)胞骨架組裝的調(diào)節(jié)有關(guān)，因此在KLEIP-/-小鼠CNV的發(fā)展過程中，角膜上皮肌動蛋白聚合可能是一個病因[26]。這些結(jié)果表明，不同轉(zhuǎn)基因小鼠CNV模型可能具有共同的發(fā)育機制。這也展示出自發(fā)CNV模型在血管生成研究中的作用，同時這些模型使得我們對CNV的機制有了更加深入的認(rèn)識。

在角膜囊袋法中，一個或多個促血管生成遞質(zhì)直接植入角膜，刺激血管和(或)淋巴管生長。然而，在基礎(chǔ)性血管生成的研究中，以血管生成的單遞質(zhì)機制為中心的還原主義方法被更為全面的觀點所取代，涉及到血管生成的相互關(guān)聯(lián)調(diào)控機制。在轉(zhuǎn)基因CNV模型中，促血管生成信號部分來源于規(guī)范的VEGF信號(如Corn1模型)或VEGF獨立信號(如晚期KLEIP-/-CNV)。在幾個轉(zhuǎn)基因模型中，可以想象幾種不同的促血管生成機制的參與。因此，轉(zhuǎn)基因模型提供了在具有良好特征和實驗可接近的環(huán)境中研究這些相互交織機制的可能性。

在經(jīng)典的角膜損傷模型中，CNV是由確切的刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的，遵循明確的發(fā)展模式。然而，一個潛在的問題是，損傷引發(fā)了過多的修復(fù)過程，其與CNV的具體關(guān)系尚不清楚。轉(zhuǎn)基因模型由于不依賴實驗干預(yù)，而是表現(xiàn)為繼發(fā)于自發(fā)病理過程的血管生成，因此開辟了一條不同的途徑。一些領(lǐng)域受益于轉(zhuǎn)基因模型的使用，例如炎癥機制的研究。CNV在外傷性模型中通常與顯著的炎癥活動有關(guān)。相應(yīng)的，在損傷模型中，抗炎治療減少了CNV。相比之下，在CNV轉(zhuǎn)基因模型中，高炎癥和低炎癥模型都是可用的。此外，在其他轉(zhuǎn)基因模型中，如KLEIP-/-模型，炎癥存在，但其與血管生成的機制尚未研究。因此，CNV的轉(zhuǎn)基因模型為研究角膜炎癥與血管生成的新機制提供了一個框架。盡管如此，轉(zhuǎn)基因模型將補充而不是取代現(xiàn)有的CNV模型。

5展望

轉(zhuǎn)基因老鼠在對CNV的研究中可以補充其他新生血管模型，其表達的自發(fā)性CNV可以不用依賴實驗干預(yù)，與其他模型相比使得有可能在更接近真實的病理生理狀態(tài)下研究新生血管，加速了對角膜血管生成的研究。此外，轉(zhuǎn)基因老鼠模型還有助于研究角膜中的各種信號分子和通路，為研究角膜血管生成的機制提供了一個方便可行的方法，有助于進一步揭示CNV發(fā)生的機制。但是，由于缺少角膜損傷的修復(fù)過程等因素，轉(zhuǎn)基因老鼠模型并不能完全取代其他的CNV模型。CNV轉(zhuǎn)基因老鼠模型的出現(xiàn)，為抗新生血管治療方案的評估提供了有力的前景，將會是研究CNV機制和治療的良好平臺。