趙賢賢，陳 菲 綜述，羅 陽 審校

(1.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，重慶 400038；2.重慶醫(yī)科大學第五臨床學院，重慶 402160；3.重慶大學生物工程學院，重慶 400045)

羅陽

石墨烯是純碳原子的六元環(huán)平面結構構成的二維材料，具有比表面積大、楊氏模量和光學透過率高、導熱性和導電性好等特點[1]。石墨烯量子點(graphene quantum dots，GQDs)作為石墨烯家族的新成員，是由小的石墨烯碎片(通常為3～20 nm)組成的新型零維度碳基納米材料[2]，不僅具有石墨烯的特性，還具有量子點典型的量子限域效應、邊緣效應和量子隧道效應[3]。因此,在光子學、復合材料、能源和電子學等領域中廣泛應用。在生物醫(yī)學領域，特別是在診斷、藥物釋放、近紅外(NIR)光熱療法、活體生物體內外成像方面，GQDs展現(xiàn)出極大的應用前景。

1 GQDs在體外檢測中的相關應用

1.1以GQDs為基礎的免疫學分析 免疫傳感器通過結合高靈敏的傳感技術與特異性免疫反應以監(jiān)測抗原抗體反應，具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡便等特點，在生物標志物檢測等方面得到廣泛應用[4]。根據(jù)轉導的類型，免疫傳感器可分為電化學式免疫傳感器、電流式免疫傳感器、壓電式免疫傳感器等。經典免疫傳感器是將抗體或抗原固定在大分子結構的膜或金屬電極上，當被固定的抗體或抗原與相應的配體結合時則可將待測物質的濃度信號轉變?yōu)橄鄳敵鲂盘朳5-6]。其中，抗原抗體固定材料的選擇決定了反應過程中抗原抗體是否會脫落，是傳感器成功與否的關鍵。石墨烯優(yōu)良的物理特性使其成為制造各種免疫傳感器的優(yōu)秀材料[7]。以下筆者將分別介紹GQDs在電化學式、電流式免疫傳感器這兩種應用最廣泛的免疫傳感器中的應用。

1.1.1電化學免疫傳感器 近年來，電化學免疫傳感器因為整合了免標記和抗原抗體相互作用的優(yōu)勢，使得檢測體系中任何能潛在反映特定蛋白質或肽存在的變化都能被測定，而獲得越來越多的關注[8]。研究人員通過在含氮的石墨烯量子點(N-GQDs)負載PtPd構建了雙金屬納米粒子(PtPd/N-GQDs)，基于此建立了能夠用于癌胚抗原(CEA)檢測的超敏傳感器。該傳感器在檢測CEA時展現(xiàn)出5 fg/mL 到 50 ng/mL的動態(tài)響應范圍，檢測下限為2 fg/mL，具有超高的檢測靈敏度[9]。同時，BHATNAGAR等[10]設計了一種基于GQD-GQD之間熒光共振能量轉移的生物傳感器以用于檢測心肌肌鈣蛋白I (cTnI)，與傳統(tǒng)檢測方法相比，該傳感器表現(xiàn)出更高的特異性、更低的檢測下限(0.192 pg/mL)以及更少的檢測時間(10 min) 。他們在另一項研究中使用石墨烯量子點聚酰胺(GQD-PAMAM)納米復合物修飾金絲網(wǎng)印刷電極的傳感器中也得到了類似的結果[11]。

1.1.2電流式免疫傳感器 與其他類型免疫傳感器相比，電流式免疫傳感器由于其微型性、穩(wěn)定性、高成本效率和易于制造等特性收獲了更廣泛的關注。HUANG等[12]研發(fā)了一種簡單的基于二氧化鈦-石墨烯、以及殼聚糖和金納米粒子(AuNPs)復合膜修飾的玻碳電極的免疫傳感器，用于血液樣本中甲胎蛋白(AFP)定量檢測，該方法通過靜電吸附帶負電荷的殼聚糖/二氧化鈦-GQD復合膜，然后用固定的AFP抗體來檢測AFP含量，應用該方法得到了一個比傳統(tǒng)檢測方法范圍更廣的檢測范圍(0.1～300.0 ng/mL)。電流式免疫傳感器的研究與電化學免疫傳感器有許多相似之處，通過GQDs的引入可極大改善所構建檢測體系的檢測效能。

1.2以GQDs為基礎的核酸檢測 基于GQDs的電化學生物傳感器為核酸檢測提供了一個簡單、準確、經濟的檢測平臺，并且能夠改善單鏈DNA(ssDNA)探針序列在各種電極基板上的固定作用[13-14]，被廣泛應用于各種核酸分析中。QIAN等[15]利用GQDs優(yōu)良的生物相容性和強大的熒光性能、DNA堿基特異性配對特性以及GQDs與碳納米管之間的熒光共振轉移構建了一種能夠實現(xiàn)低濃度DNA分析的方法。HU等[16]在黃金電極表面雜交捕獲探針，利用在雙鏈DNA結構(NH2-DNA)上組裝的活性羧基群能夠被DNA識別而構建了檢測miRNA-155的電化學體系，其中GQDs被用于通過非共價組裝實現(xiàn)過氧化物酶的固定，隨著GQDs和酶催化的結合，該生物傳感器可以檢測1 fM～100 pM濃度范圍的miRNA-155。目前，提高DNA和RNA傳感器的靈敏度和選擇性是推動GQDs應用于生物醫(yī)學領域的關鍵。

2 GQDs在體內成像中的應用

GQDs具有摩爾消光系數(shù)高、發(fā)射光譜窄、熒光穩(wěn)定性強以及生物相容性高等特性。因此，在生物醫(yī)學成像中也得到了廣泛應用[17-18]。與傳統(tǒng)的成像材料相比，GQDs具有高度穩(wěn)定性和熒光強度，成像時僅僅需要少量的GQDs即可產生可檢測的光信號。因此，應用GQDs作為體內成像的造影劑，一直受到較高關注和期望。與此同時，在深層組織成像方面，NIR發(fā)射窗因其組織吸收程度較低，在超過650 nm波長范圍時光散射率降低等有利條件使其在生物醫(yī)學成像應用方面有巨大的優(yōu)勢，因此，具有NIR反射發(fā)射特性的GQDs成為更深層組織樣本成像的候選對象[19]。有報道基于GQDs 的NIR分析儀可檢測活體細胞中抗壞血酸(AA)含量，其中提到了GQDs具有良好的雙光子熒光特性，并通過構建雙光子納米孔實現(xiàn)了檢測活體細胞內源性抗壞血酸和生物成像。在這個納米系統(tǒng)中，GQDs NIR分析儀在活體系統(tǒng)中表現(xiàn)出較低的熒光背景，極大提高了熒光成像分辨率[20]。由于活體細胞成像研究的快速發(fā)展，雜原子摻雜GQDs受到越來越多的關注。雜原子摻雜GQDs是調整帶隙、優(yōu)化GQDs電子密度和化學活動的有效方式，賦予雜原子摻雜的GQDs特殊光學效應。KUO等[21]合成一種氮摻雜GQDs(N-GQDs)用于光動力學抗菌劑治療和生物成像，結果表明NIR光譜區(qū)域含氮GQDs具有優(yōu)秀的內在發(fā)光特性和高光穩(wěn)定性，使其在追蹤細菌成像方面具有廣泛的應用前景。CHEN等[22]則報道一種量子點修飾的石墨烯材料能夠實現(xiàn)腫瘤成像、追蹤以及藥物釋放的監(jiān)控。

3 GQDs的疾病治療相關應用

3.1GQDs作為藥物載體 為提高藥物在水中的溶解度以及靶向能力，科學家們已經開發(fā)出了多種納米材料。多功能GQDs在癌癥治療中發(fā)揮著重要作用，既可以用作藥物載體，也可以用于可視化藥物輸送系統(tǒng)以了解細胞內的吸收情況，能夠在不使用外部染料且不需要考慮GQDs固有熒光的情況下實時監(jiān)測細胞內的藥物輸送情況[23]。研究結果表明，合成的葉酸(FA)共軛GQDs可以用來負載宮頸癌治療藥物——阿霉素(DOX)，這一納米裝配技術可以高準確性地將癌細胞從正常細胞中區(qū)分出來并有效地將藥物輸送到靶細胞。GQDs穩(wěn)定的固有熒光可以實時監(jiān)測細胞對DOX-GQD-FA的吸收，以及隨之發(fā)生的藥物釋放，通過受體介導的內吞作用，子宮頸癌傳代細胞(HeLa細胞)迅速地被內化，整個過程中藥物釋放和積累時間延長。在體外毒性方面，DOX-GQD-FA的納米結構可以對靶向的HeLa細胞和非靶細胞產生不同的效果，從而能夠顯著降低對非靶向細胞的毒性[24]。同時，基于GQDs標記的受體介導內吞作用預示著一種更準確、更有選擇性的癌癥診斷方法。此外，有研究表明一種多模式工具混合納米體系可用于癌細胞成像和癌癥治療，在光動力增強生物氧化還原療法和光熱療法中，GQDs常被用作多功能的納米載體來負載釓卟啉和镥卟啉兩種光敏抗癌藥物，以及在腫瘤治療過程中能顯示腫瘤反應的深紅色熒光，同時，也能夠在增強MRI中成像[25]。GQDs可以通過其獨特的兩面和邊緣結構來提高藥物的裝載能力，KHODADADEI等[26]合成了10 nm大小的含氮GQDs(N-GQDs)和10層石墨負載甲氨蝶呤(MTX)來構建出一個藥物輸送系統(tǒng)，結果顯示GQDs作為納米載體可以延長藥物的靶細胞毒性作用，因而具有更強的抗腫瘤細胞活性。

3.2GQDs在疾病光治療中的應用 光療是癌癥治療中一種比較有前景的治療方法，與傳統(tǒng)外科手術以及放化療對患者機體正常組織細胞損傷不同，光療能夠顯著減少腫瘤藥物的全身毒性，并能提高放化療治療效果。光療包括光動力療法和光熱療法，光熱療法是利用有較高光熱轉換效率的材料，在其被注入體內后，能夠靶向聚集在腫瘤組織部位，此時當其被特定波長的光(一般是NIR)照射后能夠將光子轉化為氧自由基，作用于周圍腫瘤細胞并導致其消融，從而達到清除癌細胞的目的[27]。第1代和第2代光敏劑主要包括貴金屬納米顆粒和碳納米管，其中無機量子點CdSe和CdTe已應用于臨床，GQDs因有較大的光熱轉換面積、較高的靶向性以及在NIR區(qū)高效的光熱轉換能力而成為目前研究熱點。ISAKOVIC等[28]通過電化學方法制備粒徑3～7 nm的GQDs，發(fā)現(xiàn)這種量子點在進入膠質瘤細胞后能夠在470 nm波長的光照下殺死膠質瘤細胞。

3.3GQDs在殺菌中的應用 羅陽團隊報道納米級氧化石墨烯能夠通過物理方式殺菌，為清除超級細菌，解決日益嚴峻的細菌耐藥難題提供了新的方法[29]，盡管石墨烯殺菌的研究十分火熱，但是關于GQDs殺菌的報道并不多[30]。胡超[31]以GQDs和銀氨溶液為原料，通過原位還原法制備了GQDs-Ag復合納米材料，并發(fā)現(xiàn)GQDs-Ag能夠抑制大腸桿菌的生長，阻礙禾谷鐮刀菌孢子的萌發(fā)，對細菌和真菌都具有良好的抗菌性能，該復合物最低抑菌濃度在10 μg/mL。上述實驗說明GQDs具有協(xié)同殺菌效果，但是單獨的GQDs殺菌的研究仍未見報道。

4 GQDs材料的毒性

GQDs納米材料的毒性是其在生物技術應用中面臨的主要挑戰(zhàn)之一。一項關于石墨烯材料細胞毒性的研究表明，小于50 nm的GQDs對細胞沒有明顯的毒性[32]。盡管大多數(shù)單一劑量實驗顯示GQDs納米材料沒有明顯的積累而是呈現(xiàn)出低毒性，但其體內毒性研究需要采用模擬臨床藥物管理的多劑量試驗，以進一步研究GQDs的生物安全性。NURUNNABI等[33]對羥基化的GQDs進行了體外細胞毒性研究，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細胞毒性。PENG等[34]發(fā)現(xiàn)濃度為40 μg/mL的納米級石墨烯氧化物不會對HeLa細胞產生嚴重的急性細胞毒性反應。LI等[35]觀察到，在高達100 μg/mL的氧化石墨烯納米顆粒劑量下培育胃癌細胞和皮膚細胞沒有明顯的細胞死亡。由于DNA損傷、變異和癌癥之間存在密切的相關性，因此，在GQDs的細胞毒性研究中，評估其對DNA潛在損傷意義重大。在WANG等[36]通過對DNA損傷相關蛋白激活的流式細胞學分析，以及GQDs用于治療時對NIH-3 T3細胞的細胞吸收、細胞死亡和細胞增殖的研究，探討了GQDs對NIH-3 T3細胞的基因毒性，其中GQDs誘導的活性氧(ROS)生成則被確定為DNA損傷的潛在原因。YUAN等[37]研究了3個不同的官能團[NH2,COOH,CO-N(CH3)2]修飾后的GQDs的細胞分布，并與A549和C6細胞中的細胞毒性比較。結果表明，與不同的化學基團進行耦合改性后，GQDs仍然具有良好的生物相容性和較低的細胞毒性，這使得它們在生物成像和其他生物醫(yī)學應用方面將更前景[37]。

此外，MARKOVIC等[38]分析了GQDs介導光動力細胞毒性的分子機制，結果顯示體外氧化應激產生了光動力細胞毒性，并引起細胞凋亡和程序性死亡。然而在乳腺癌研究中卻顯示GQDs是非毒性物質，GQDs可以迅速進入細胞質并且不干擾細胞增殖[39]。因此，GQDs的細胞毒性仍需進一步研究，通過不斷探索GQDs的安全性，為其大規(guī)模臨床使用奠定基礎。

5 結論與展望

隨著GQDs合成方法的不斷改進和革新，各種性能優(yōu)良的GQDs被逐漸報道。由于尺寸和形狀對GQDs的物理化學性質有巨大的影響，因此，如果基于GQDs的熒光檢測方法想要逐漸取代傳統(tǒng)的實驗室檢測技術，仍需實現(xiàn)GQDs的大規(guī)模、高效率穩(wěn)定生產。目前，盡管基于GQDs在生物醫(yī)藥應用的進展令人興奮和鼓舞人心，但仍然面臨著許多挑戰(zhàn)。特別是在免疫傳感器方面，基于GQDs的免疫傳感仍處于起步階段。需要更多腫瘤標志物、疾病診斷相關的免疫傳感器應用的研究，更多基于GQDs的超敏免疫傳感器的構建為疾病診斷和治療提供支撐。GQDs具有不同顏色的光致發(fā)光(PL)特性，雖然對這一特性已經提出了一些可能的機制，如尺寸效應、表面修飾和其他元素摻雜，但關于GQDs的光致發(fā)光特性了解仍然很貧乏，限制了其在免疫傳感方面的應用空間，慶幸的是研究人員正開發(fā)一系列新的表面修飾策略，GQDs無疑將被用于更多更有創(chuàng)意的生物醫(yī)學應用領域。

總之，GQDs作為一種新型的納米復合材料，其在生物醫(yī)學領域的應用依賴于包括化學、物理、生物學和醫(yī)學在內的多個學科之間的有效協(xié)作。本綜述總結了近年來基于GQDs的納米材料的研究進展，重點介紹了其在體外和體內的生物醫(yī)學應用，以及細胞水平的GQDs的體內毒性。然而關于GQDs在生物醫(yī)學中的應用仍有許多尚未解決的問題，只有不斷研究GQDs的生物毒性以及排泄機制，才能促進基于GQDs的納米材料在生物醫(yī)學方面得到更廣泛的應用。