張 勇 孫廣男 康 晶 覃雅倩 銀 鐸

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第二微創(chuàng)婦科，遼寧省沈陽(yáng)市 110004，電子郵箱：yonger20120817@126.com)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，也是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，70%～80%的病例在診斷時(shí)已為晚期，患者的5年生存率僅為30%～40%[1]。卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌(ovarian endometrioid adenocarcinoma，OEA)發(fā)病率較低，僅占卵巢全部腫瘤的2%，占上皮性卵巢癌的16%～25%[2]。OEA組織病理學(xué)特點(diǎn)和子宮內(nèi)膜癌相似，臨床表現(xiàn)缺乏特異性，患者在確診時(shí)往往已發(fā)展到中晚期，且在治療后期難以突破對(duì)化療藥產(chǎn)生耐藥性的“瓶頸”，因此患者的臨床預(yù)后較差，死亡率較高。波形蛋白是一種Ⅲ型中間絲蛋白，目前已被證實(shí)在多種腫瘤組織中異常高表達(dá)，與腫瘤患者的臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān)，其作為一種生物學(xué)標(biāo)志物已被廣泛用于多種腫瘤的臨床診斷及預(yù)后的評(píng)估[3-6]。但目前關(guān)于波形蛋白在OEA組織中表達(dá)的研究鮮有報(bào)道。本研究運(yùn)用免疫組化法分別檢測(cè)正常卵巢、卵巢子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢交界性子宮內(nèi)膜樣腫瘤和OEA組織中波形蛋白的表達(dá)水平，旨在探討波形蛋白在OEA的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，及其與OEA患者臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年1月至2015年12月在我院診治的110例婦科患者的卵巢腫瘤或正常卵巢組織，其中OEA 40例、卵巢交界性子宮內(nèi)膜樣腫瘤10例、卵巢子宮內(nèi)膜異位癥30例、因?qū)m頸癌而手術(shù)切除卵巢且術(shù)后病理證實(shí)為正常的卵巢組織30例。所有病例均為初發(fā)且術(shù)前未經(jīng)任何治療，所收集組織均為手術(shù)切除后經(jīng)本院病理科確診的石蠟標(biāo)本。OEA患者年齡23～78歲，中位年齡49歲，年齡≤50歲18例、>50歲22例；國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)分期Ⅰ期15例，Ⅱ期9例，Ⅲ期15例，Ⅳ期1例；分化程度：低分化16例，中分化17例，高分化7例；伴淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移23例，不伴淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移17例。

1.2 檢測(cè)試劑與方法 鼠抗人波形蛋白單克隆抗體(批號(hào)：17A10709)、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)(streptavidin-perosidase，SP)法超敏試劑盒(批號(hào)：K175622G)和二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(批號(hào)：K176614A)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。將收集的標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。將石蠟組織塊切成4 μm厚切片，按SP法和抗體試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后用磷酸緩沖鹽溶液清洗，孵育后滴加一抗(鼠抗人波形蛋白單克隆抗體，1∶100)，4℃過(guò)夜。滴加100 μl山羊抗小鼠波形蛋白二抗(1∶200；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：K185208D)，37℃孵育1 h。以磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為空白對(duì)照。應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染、樹(shù)脂封片。

1.3 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]在400倍顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為波形蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分；按著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最終采用半定量計(jì)分法判定結(jié)果，即將陽(yáng)性細(xì)胞比例和著色強(qiáng)度的評(píng)分?jǐn)?shù)相乘計(jì)算綜合得分，以<3分為陰性表達(dá)，≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。以上免疫組化染色結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)生通過(guò)獨(dú)立雙盲法讀片評(píng)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法；采用趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)分析波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與疾病發(fā)展程度的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 波形蛋白在4種卵巢組織中的表達(dá)情況 波形蛋白主要表達(dá)于OEA和卵巢交界性子宮內(nèi)膜樣腫瘤組織的細(xì)胞質(zhì)中(見(jiàn)圖1及圖2)。在正常卵巢組織、卵巢子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢交界性子宮內(nèi)膜樣腫瘤和OEA組織中，波形蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為6.67%(2/30)、43.33%(13/30)、60.00%(6/10)、85.00%(34/40)，呈上升趨勢(shì)(χ2=41.799，P<0.001)。

圖1 波形蛋白在OEA組織中的表達(dá)(SP法，×400)

圖2 波形蛋白在卵巢交界性子宮內(nèi)膜樣腫瘤組織中的表達(dá)(SP法，×400)

2.2 不同臨床病理特征OEA患者癌組織的波形蛋白表達(dá)情況 FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期者、伴淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者癌組織的波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別高于Ⅰ～Ⅱ期者、無(wú)淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者(均P<0.05)。不同年齡、分化程度患者癌組織的波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理特征OEA患者癌組織的波形蛋白表達(dá)情況[n(%)]

注：*Fisher確切概率法。

3 討 論

波形蛋白是一種直徑約10 nm的Ⅲ型中間絲蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為57 000，由464個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。作為一種結(jié)構(gòu)蛋白，波形蛋白在細(xì)胞中形成一個(gè)由中央向周圍呈放射狀的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將線粒體、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器錨定在細(xì)胞特定的空間，與微絲、微管共同構(gòu)建起完整的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞形態(tài)完整性的維持有著重要作用。越來(lái)越多的研究表明波形蛋白廣泛分布于人體多種器官組織，其表達(dá)水平的異常升高與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，且對(duì)疾病的進(jìn)展有推動(dòng)作用[8-12]。但其中相關(guān)作用機(jī)制尚不清楚，目前公認(rèn)的是波形蛋白能在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生，而EMT是腫瘤發(fā)生進(jìn)展重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，可使原有的上皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變并轉(zhuǎn)化成間充質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。因此，波形蛋白也成為臨床上常見(jiàn)的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志之一，對(duì)患者的臨床治療及預(yù)后的評(píng)估有著重要的指導(dǎo)意義。

相比于其他腫瘤，波形蛋白在卵巢癌組織中的相關(guān)研究起步較晚，且現(xiàn)有的報(bào)道多以常見(jiàn)的上皮性卵巢癌(如卵巢漿液性腺癌、黏液性腺癌)為研究對(duì)象[14-17]。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)相比于良性卵巢腫瘤和交界性卵巢腫瘤，上皮性卵巢癌組織中波形蛋白表達(dá)水平上調(diào)，能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，且其高表達(dá)影響腫瘤患者的總生存率和無(wú)病生存率。周丹丹等[15]的研究也證實(shí)，波形蛋白在上皮性卵巢癌組織中呈高表達(dá)，且與臨床分期、分化程度和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示波形蛋白還可能與患者的預(yù)后情況有關(guān)。Kenda等[16]也在卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)波形蛋白表達(dá)水平異常升高，并在顯微鏡下觀察到該類細(xì)胞逐漸失去原有圓形的細(xì)胞形態(tài)，轉(zhuǎn)變成具有“觸手”的間充質(zhì)細(xì)胞，并且由腫瘤組織的表面向深部侵襲，提示波形蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT可能是上皮性卵巢癌發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的重要作用機(jī)制。

OEA是臨床上相對(duì)少見(jiàn)的上皮性卵巢癌，因缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，在疾病早期階段難以被發(fā)現(xiàn)，因此OEA患者的臨床治療效果往往不佳，有較高的死亡率。關(guān)于OEA的組織學(xué)起源，大多數(shù)學(xué)說(shuō)認(rèn)為其是卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的惡變，Huang等[18]報(bào)告42%的OEA患者合并卵巢子宮內(nèi)膜異位癥；任芳等[19]也發(fā)現(xiàn)50%以上的OEA病例由卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶發(fā)生惡變而來(lái)。但是目前關(guān)于OEA的進(jìn)展過(guò)程及機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，正常卵巢組織、卵巢子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢交界性子宮內(nèi)膜樣腫瘤和OEA組織中波形蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率呈上升趨勢(shì)(P<0.05)，其在OEA組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)85.00%，且Ⅲ～Ⅳ期者、伴淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者癌組織的波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別高于Ⅰ～Ⅱ期者、無(wú)淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者(均P<0.05)，提示波形蛋白在OEA組織中呈高表達(dá)，且可能與患者的病情進(jìn)展、腫瘤轉(zhuǎn)移等有關(guān)。由此我們推測(cè)波形蛋白的高表達(dá)可能參與了OEA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并促進(jìn)其侵襲和轉(zhuǎn)移，這與其他類型上皮性卵巢癌的相關(guān)研究結(jié)論相似。因此，波形蛋白在一定程度上能夠輔助對(duì)OEA的臨床診斷，對(duì)患者的預(yù)后評(píng)估也有一定的參考價(jià)值。但不同年齡、分化程度患者癌組織的波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，與其他類型上皮性卵巢癌的相關(guān)研究結(jié)論不一致，這可能與我們的研究病例數(shù)較少有關(guān)。此外，一項(xiàng)研究結(jié)果表明在OEA組織中波形蛋白呈低表達(dá)[20]，這與我們的研究結(jié)論相悖，提示波形蛋白在OEA組織中的表達(dá)情況還存在爭(zhēng)議，仍需要大樣本進(jìn)行深入研究。

綜上所述，波形蛋白在OEA組織中呈高表達(dá)，可能參與OEA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，且與OEA患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。但波形蛋白能否在臨床上作為一種協(xié)助評(píng)估OEA治療效果和預(yù)后的新型生物學(xué)指標(biāo)，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。