苑志宇，董楊云逸，李 錳，呂文發(fā)，王 軍

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省反芻動物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130118）

光照是重要的生態(tài)因子，它不僅為生物提供生存所必需的能量，還以波長、光照強(qiáng)度和光照周期等屬性影響生物生長、發(fā)育和繁殖等生命活動[1]。光照可對禽類性成熟和后續(xù)繁殖性能進(jìn)行調(diào)控。1921年Rowman首次通過試驗(yàn)證實(shí)了光周期對禽類繁殖的影響，此后國內(nèi)外學(xué)者開展了大量研究關(guān)于光照對禽類（家雞、鴿子、鵪鶉等）繁殖的影響，但研究多集中于光照對母禽生產(chǎn)和繁殖的影響[2]。隨著禽類人工授精技術(shù)的發(fā)展，光照對公禽繁殖性能影響的研究日益增多[3]。研究光照對公禽繁殖性能的作用規(guī)律、公禽繁殖系統(tǒng)對光信號的生物應(yīng)答機(jī)制，以及在相關(guān)研究成果基礎(chǔ)上制定合理的光照制度，均為現(xiàn)代禽類養(yǎng)殖業(yè)的高效生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[4]。本試驗(yàn)旨在探究不同光照周期對肉種雞睪酮合成的影響，以期為公禽光照調(diào)控技術(shù)的改進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將120只20周齡父母代AA種公雞隨機(jī)分配到3個(gè)隔間，每個(gè)隔間分為10個(gè)雞籠，每籠4只雞，3個(gè)隔間分別采用不同光照周期（SD、CTR 、LD組分別為8L:16D、12.5L:11.5D、16L:8D），飼喂全價(jià)日糧，自由采食和飲水飼喂4周，每籠隨機(jī)選取1只雞進(jìn)行采樣，每組共10個(gè)重復(fù)，翅下采集血液，頸動脈放血致死，每只雞左側(cè)睪丸用于組織切片，右側(cè)睪丸置于-80 冰箱保存用于分子試驗(yàn)。

1.2 睪丸組織切片HE染色 采集不同光照組雞睪丸，置于4%多聚甲醛中固定48 h后，將組織樣修飾到大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm的立體組織塊。放置于包埋盒中，流水沖洗12 h。經(jīng)酒精梯度脫水后浸入二甲苯中透明15 min 2次，浸入軟蠟中30 min 2次，浸入硬蠟中30 min 2次。利用包埋機(jī)對組織進(jìn)行包埋，修成凸起的組織樣本進(jìn)行切片，制成5 μm的組織切片后進(jìn)行HE染色。普通光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸組織切片，評價(jià)曲細(xì)精管橫截面積及精子發(fā)生情況。

1.3 睪酮含量測定 采集翅下靜脈血液，3 000 r/min 離心15 min，析出血清，用ELISA睪酮檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）分別測定3個(gè)光照組雞血液中睪酮含量。

1.4 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 將睪丸組織樣品于液氮中磨取，后加入1 mL Trizol中進(jìn)行裂解，按照RNA提取方法進(jìn)行試驗(yàn)，并測定RNA樣品OD值，有效值在1.9～2.0的樣本進(jìn)行下一步試驗(yàn)。統(tǒng)一RNA濃度后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）說明書步驟進(jìn)行cDNA合成。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)雞StAR、Cyp11a1及3β-HSD基因熒光定量PCR引物（表1），β-actin引物購自上海生工生物工程股份有限公司。試驗(yàn)采用 20 μL 體系：SYBR 10 μL，cDNA 2 μL，水 6 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，ROX 1 μL。所有反應(yīng)設(shè)置3個(gè)副孔，重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果采用相對定量法進(jìn)行分析。

1.6 Western blot 使用RIPA緩沖液提取總蛋白質(zhì)。通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒（Beyotime）測定蛋白質(zhì)濃度。將每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)（20 μg）點(diǎn)樣到12% SDS-PAGE凝膠電泳中，通過電泳分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上。用5%脫脂牛奶封閉2 h后，一級抗體（表2）4 孵育過夜。TBST 3次重復(fù)洗滌步驟后，將膜與二抗（表3）在室溫下孵育1 h。用ECL發(fā)光液顯影，用Tanon Gis 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 17.5 軟件進(jìn)行單因素方差分析比較組間差異性，用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用GraphPad Prism 5 作圖軟件制圖，不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照周期對雞睪丸形態(tài)功能的影響 通過鏡下觀察不同光照周期睪丸切片，結(jié)果顯示（圖1和圖2），隨著光照周期延長曲細(xì)精管橫截面積極顯著增大（P＜0.01），SD組曲細(xì)精管內(nèi)出現(xiàn)各級生精細(xì)胞，但未見有精子，而CTR與LD組曲細(xì)精管內(nèi)出現(xiàn)大量精子。

2.2 不同光照周期對公雞血液中睪酮含量的影響 如圖3所示，隨著光照時(shí)間延長睪酮含量極顯著升高（P＜0.01），與SD組相比， CTR組和LD組睪酮含量均極顯著升高（P＜0.01）。

表2 Western blot一抗、二抗信息

圖1 不同光照組雞睪丸組織切片圖

圖2 不同光照組雞曲細(xì)精管橫截面積對比

2.3 不同光照周期對雞睪丸睪酮合成關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)量的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示（圖4），雞睪丸組織中StAR、Cyp11a1和3β-HSDmRNA表達(dá)量隨光照周期增加極顯著升高（P＜0.01）。與SD組相比， CTR和LD組睪酮合成關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)量均極顯著升高（P＜0.01）。

圖3 不同光照對公雞血清中睪酮含量的影響

圖4 不同光照組雞睪丸StAR、Cyp11a1及3β-HSD mRNA表達(dá)

2.4 不同光照周期對雞睪丸睪酮合成關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)量的影響 如圖5所示，雞睪丸組織中StAR、Cyp11a1和3β-HSD 蛋白表達(dá)量隨光照周期增加極顯著升高（P＜0.01）。與SD組相比，CTR組和LD組睪酮合成關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)量依次顯著升高（P＜0.01）。

圖5 不同光照組雞睪丸StAR、Cyp11a1及3β-HSD蛋白表達(dá)

3 討 論

光照周期作為繁殖性能主要影響因素之一，其作用在于改變下丘腦-垂體-性腺軸活動。生精能力是評價(jià)雄性動物性腺發(fā)育的重要指標(biāo)，睪丸體積和曲細(xì)精管橫截面積均影響生精能力。張振漢等[5]研究表明，對照組小鼠睪丸的重量、曲細(xì)精管管徑大小及管壁厚度均大于光照缺乏組，睪丸內(nèi)相同發(fā)育階段的生精細(xì)胞數(shù)量也明顯高于光照缺乏組，光照缺乏對性腺發(fā)育影響極大。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著光照周期延長曲細(xì)精管橫截面積顯著增大，SD組曲細(xì)精管內(nèi)出現(xiàn)各級生精細(xì)胞，但未見有精子，而CTR與LD組曲細(xì)精管內(nèi)出現(xiàn)大量精子。李琴等[6]也發(fā)現(xiàn)延長光照周期能增強(qiáng)公雞性腺發(fā)育。

睪酮分泌水平是評價(jià)雄性動物性腺發(fā)育的重要指標(biāo)，95%的睪酮在睪丸中分泌[7]。金寶棟[8]測定了不同光照周期對東北籽鵝睪酮等生殖激素水平的影響，發(fā)現(xiàn)長光照（15L:9D）飼養(yǎng)后睪酮分泌量顯著升高，籽鵝生殖激素水平變化受光照時(shí)間影響，不同光照周期呈不同的變化規(guī)律。本試驗(yàn)中，給予不同光照處理后，公雞血清中睪酮含量隨光照時(shí)長呈梯度上升趨勢。AA公雞在20～24周齡為性成熟發(fā)育高峰期[9]，受光照周期影響更大，本試驗(yàn)中長光照組肉髯雞冠等第二性征整體較其他2組發(fā)育更好，解剖時(shí)睪丸體積更大。

實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果表明，在不同光照周期飼養(yǎng)條件下，雞睪丸中褪黑素合成酶和褪黑素受體表達(dá)量隨光照周期延長而顯著下調(diào)，且有規(guī)律地延長光照時(shí)間能降低松果腺分泌的褪黑素含量[11]。據(jù)報(bào)道，持續(xù)光照使幼年小鼠生殖激素水平提高，延長光照抑制松果體細(xì)胞增殖和褪黑素的分泌，可促進(jìn)下丘腦—垂體—睪丸軸的調(diào)控，使睪酮分泌量增加，導(dǎo)致性發(fā)育提前[12]。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞是主要的睪酮分泌細(xì)胞。有研究表明，褪黑素通過下調(diào)睪酮合成關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Mel1a、GATA-4、StAR和3β-HSD抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌[13]。本試驗(yàn)通過熒光定量PCR和Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證，睪酮分泌3個(gè)關(guān)鍵酶（StAR、Cyp11a1、3β-HSD）隨光照周期延長呈梯度上升趨勢，LD組表達(dá)量最高。光照對公雞睪酮分泌的刺激作用主要影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞的新陳代謝實(shí)現(xiàn)。隨著家禽繁育技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)階段提高種公雞繁殖率勢在必行[14]。光照條件對家禽繁育至關(guān)重要，延長光照周期有利于提高公雞繁殖性能，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步通過細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，延長光照周期能有效提高公雞睪酮合成水平，其作用可能通過上調(diào)睪酮合成關(guān)鍵酶（StAR、Cyp11a1、3β-HSD）表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，且延長光照周期有利于提高睪丸生精能力。