苑志宇，董楊云逸，李 錳，呂文發(fā)，王 軍

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林省反芻動物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實驗室，吉林長春130118）

光照是重要的生態(tài)因子，它不僅為生物提供生存所必需的能量，還以波長、光照強度和光照周期等屬性影響生物生長、發(fā)育和繁殖等生命活動[1]。光照可對禽類性成熟和后續(xù)繁殖性能進行調(diào)控。1921年Rowman首次通過試驗證實了光周期對禽類繁殖的影響，此后國內(nèi)外學者開展了大量研究關(guān)于光照對禽類（家雞、鴿子、鵪鶉等）繁殖的影響，但研究多集中于光照對母禽生產(chǎn)和繁殖的影響[2]。隨著禽類人工授精技術(shù)的發(fā)展，光照對公禽繁殖性能影響的研究日益增多[3]。研究光照對公禽繁殖性能的作用規(guī)律、公禽繁殖系統(tǒng)對光信號的生物應(yīng)答機制，以及在相關(guān)研究成果基礎(chǔ)上制定合理的光照制度，均為現(xiàn)代禽類養(yǎng)殖業(yè)的高效生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[4]。本試驗旨在探究不同光照周期對肉種雞睪酮合成的影響，以期為公禽光照調(diào)控技術(shù)的改進提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 將120只20周齡父母代AA種公雞隨機分配到3個隔間，每個隔間分為10個雞籠，每籠4只雞，3個隔間分別采用不同光照周期（SD、CTR 、LD組分別為8L:16D、12.5L:11.5D、16L:8D），飼喂全價日糧，自由采食和飲水飼喂4周，每籠隨機選取1只雞進行采樣，每組共10個重復，翅下采集血液，頸動脈放血致死，每只雞左側(cè)睪丸用于組織切片，右側(cè)睪丸置于-80 冰箱保存用于分子試驗。

1.2 睪丸組織切片HE染色 采集不同光照組雞睪丸，置于4%多聚甲醛中固定48 h后，將組織樣修飾到大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm的立體組織塊。放置于包埋盒中，流水沖洗12 h。經(jīng)酒精梯度脫水后浸入二甲苯中透明15 min 2次，浸入軟蠟中30 min 2次，浸入硬蠟中30 min 2次。利用包埋機對組織進行包埋，修成凸起的組織樣本進行切片，制成5 μm的組織切片后進行HE染色。普通光學顯微鏡下觀察睪丸組織切片，評價曲細精管橫截面積及精子發(fā)生情況。

1.3 睪酮含量測定 采集翅下靜脈血液，3 000 r/min 離心15 min，析出血清，用ELISA睪酮檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）分別測定3個光照組雞血液中睪酮含量。

1.4 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 將睪丸組織樣品于液氮中磨取，后加入1 mL Trizol中進行裂解，按照RNA提取方法進行試驗，并測定RNA樣品OD值，有效值在1.9～2.0的樣本進行下一步試驗。統(tǒng)一RNA濃度后，進行反轉(zhuǎn)錄試驗，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）說明書步驟進行cDNA合成。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.5 實時熒光定量PCR 利用Oligo7軟件設(shè)計雞StAR、Cyp11a1及3β-HSD基因熒光定量PCR引物（表1），β-actin引物購自上海生工生物工程股份有限公司。試驗采用 20 μL 體系：SYBR 10 μL，cDNA 2 μL，水 6 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，ROX 1 μL。所有反應(yīng)設(shè)置3個副孔，重復3次，試驗結(jié)果采用相對定量法進行分析。

1.6 Western blot 使用RIPA緩沖液提取總蛋白質(zhì)。通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒（Beyotime）測定蛋白質(zhì)濃度。將每個樣品的蛋白質(zhì)（20 μg）點樣到12% SDS-PAGE凝膠電泳中，通過電泳分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上。用5%脫脂牛奶封閉2 h后，一級抗體（表2）4 孵育過夜。TBST 3次重復洗滌步驟后，將膜與二抗（表3）在室溫下孵育1 h。用ECL發(fā)光液顯影，用Tanon Gis 軟件進行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計分析 用SPSS 17.5 軟件進行單因素方差分析比較組間差異性，用LSD法進行多重比較，結(jié)果以平均值±標準差表示，用GraphPad Prism 5 作圖軟件制圖，不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照周期對雞睪丸形態(tài)功能的影響 通過鏡下觀察不同光照周期睪丸切片，結(jié)果顯示（圖1和圖2），隨著光照周期延長曲細精管橫截面積極顯著增大（P＜0.01），SD組曲細精管內(nèi)出現(xiàn)各級生精細胞，但未見有精子，而CTR與LD組曲細精管內(nèi)出現(xiàn)大量精子。

2.2 不同光照周期對公雞血液中睪酮含量的影響 如圖3所示，隨著光照時間延長睪酮含量極顯著升高（P＜0.01），與SD組相比， CTR組和LD組睪酮含量均極顯著升高（P＜0.01）。

表2 Western blot一抗、二抗信息

圖1 不同光照組雞睪丸組織切片圖

圖2 不同光照組雞曲細精管橫截面積對比

2.3 不同光照周期對雞睪丸睪酮合成關(guān)鍵酶mRNA表達量的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示（圖4），雞睪丸組織中StAR、Cyp11a1和3β-HSDmRNA表達量隨光照周期增加極顯著升高（P＜0.01）。與SD組相比， CTR和LD組睪酮合成關(guān)鍵酶mRNA表達量均極顯著升高（P＜0.01）。

圖3 不同光照對公雞血清中睪酮含量的影響

圖4 不同光照組雞睪丸StAR、Cyp11a1及3β-HSD mRNA表達

2.4 不同光照周期對雞睪丸睪酮合成關(guān)鍵酶蛋白表達量的影響 如圖5所示，雞睪丸組織中StAR、Cyp11a1和3β-HSD 蛋白表達量隨光照周期增加極顯著升高（P＜0.01）。與SD組相比，CTR組和LD組睪酮合成關(guān)鍵酶蛋白表達量依次顯著升高（P＜0.01）。

圖5 不同光照組雞睪丸StAR、Cyp11a1及3β-HSD蛋白表達

3 討 論

光照周期作為繁殖性能主要影響因素之一，其作用在于改變下丘腦-垂體-性腺軸活動。生精能力是評價雄性動物性腺發(fā)育的重要指標，睪丸體積和曲細精管橫截面積均影響生精能力。張振漢等[5]研究表明，對照組小鼠睪丸的重量、曲細精管管徑大小及管壁厚度均大于光照缺乏組，睪丸內(nèi)相同發(fā)育階段的生精細胞數(shù)量也明顯高于光照缺乏組，光照缺乏對性腺發(fā)育影響極大。本試驗發(fā)現(xiàn)，隨著光照周期延長曲細精管橫截面積顯著增大，SD組曲細精管內(nèi)出現(xiàn)各級生精細胞，但未見有精子，而CTR與LD組曲細精管內(nèi)出現(xiàn)大量精子。李琴等[6]也發(fā)現(xiàn)延長光照周期能增強公雞性腺發(fā)育。

睪酮分泌水平是評價雄性動物性腺發(fā)育的重要指標，95%的睪酮在睪丸中分泌[7]。金寶棟[8]測定了不同光照周期對東北籽鵝睪酮等生殖激素水平的影響，發(fā)現(xiàn)長光照（15L:9D）飼養(yǎng)后睪酮分泌量顯著升高，籽鵝生殖激素水平變化受光照時間影響，不同光照周期呈不同的變化規(guī)律。本試驗中，給予不同光照處理后，公雞血清中睪酮含量隨光照時長呈梯度上升趨勢。AA公雞在20～24周齡為性成熟發(fā)育高峰期[9]，受光照周期影響更大，本試驗中長光照組肉髯雞冠等第二性征整體較其他2組發(fā)育更好，解剖時睪丸體積更大。

實驗室前期結(jié)果表明，在不同光照周期飼養(yǎng)條件下，雞睪丸中褪黑素合成酶和褪黑素受體表達量隨光照周期延長而顯著下調(diào)，且有規(guī)律地延長光照時間能降低松果腺分泌的褪黑素含量[11]。據(jù)報道，持續(xù)光照使幼年小鼠生殖激素水平提高，延長光照抑制松果體細胞增殖和褪黑素的分泌，可促進下丘腦—垂體—睪丸軸的調(diào)控，使睪酮分泌量增加，導致性發(fā)育提前[12]。

睪丸間質(zhì)細胞是主要的睪酮分泌細胞。有研究表明，褪黑素通過下調(diào)睪酮合成關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Mel1a、GATA-4、StAR和3β-HSD抑制小鼠睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌[13]。本試驗通過熒光定量PCR和Western blot進一步驗證，睪酮分泌3個關(guān)鍵酶（StAR、Cyp11a1、3β-HSD）隨光照周期延長呈梯度上升趨勢，LD組表達量最高。光照對公雞睪酮分泌的刺激作用主要影響睪丸間質(zhì)細胞的新陳代謝實現(xiàn)。隨著家禽繁育技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)階段提高種公雞繁殖率勢在必行[14]。光照條件對家禽繁育至關(guān)重要，延長光照周期有利于提高公雞繁殖性能，具體機制仍需進一步通過細胞生物學試驗驗證。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，延長光照周期能有效提高公雞睪酮合成水平，其作用可能通過上調(diào)睪酮合成關(guān)鍵酶（StAR、Cyp11a1、3β-HSD）表達而實現(xiàn)，且延長光照周期有利于提高睪丸生精能力。