仝亞軍，高玉錄，劉孟龍，翟衡，孫慶華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018)

褪黑素(melatonin，MT)是一種廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的吲哚類小分子物質(zhì)。研究證明褪黑素在提高植物抗氧化能力、增強(qiáng)抗逆性方面有重要作用，外源褪黑素能緩解鹽脅迫對(duì)光合速率的抑制作用，抑制葉綠素的降解，在緩解高溫、臭氧逆境脅迫方面也有明顯效果[1-3]。外源褪黑素可減輕胡蘿卜(Daucus carota)因低溫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[4]；褪黑素預(yù)處理的黃瓜種子在低溫條件下發(fā)芽率明顯提高[5]；褪黑素能提高低溫保存的紅景天(Cryssulaceae Rhodiola crenulata)愈傷組織的存活率。褪黑素在植株葉片或根局部施用不僅在施用部位誘導(dǎo)對(duì)低溫脅迫的耐受性，而且還可提高全株的耐寒性[6]。

中國(guó)北方屬于大陸性季風(fēng)氣候，春季升溫快，但氣溫變化波動(dòng)大，發(fā)芽早的果樹(shù)容易受到低溫傷害。春季霜凍造成葡萄嫩梢、葉片、花器官發(fā)生凍害是是導(dǎo)致葡萄產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降甚至樹(shù)體死亡的重要因素之一，所以研發(fā)葡萄防霜技術(shù)具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。葉面噴施碧護(hù)、天達(dá)已被生產(chǎn)證實(shí)是預(yù)防和救護(hù)果樹(shù)霜凍害的有效方法[7-9]，本研究以褪黑素、天達(dá)、碧護(hù)為處理，探討外源褪黑素預(yù)防霜凍的作用。

1 材料與方法

1.1 試材

試驗(yàn)于2018年4月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院葡萄試驗(yàn)基地進(jìn)行。以5年生籬架栽培的砧木SN15為試材。南北行向，株行距1.2m×2.5m，單干單臂垂直葉幕。

試劑：褪黑素購(gòu)自Sigma公司；天達(dá)2116購(gòu)自山東天達(dá)生物股份有限公司(凈含量20mL)；碧護(hù)購(gòu)自德國(guó)阿格福萊農(nóng)林環(huán)境生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置

設(shè)置4個(gè)處理，分別為①CK，自然霜凍條件下不作處理。②褪黑素100nmol/L。③碧護(hù)5000倍液。④天達(dá)600倍液。每個(gè)處理選長(zhǎng)勢(shì)一致的3株為1個(gè)重復(fù)，每處理重復(fù)3次，共9株。根據(jù)天氣預(yù)報(bào)降溫信息，各處理于4月5日即低溫來(lái)臨前1天噴施，于6日上午10時(shí)采樣。統(tǒng)一選取新梢上部第1個(gè)葉片用液氮速凍后放-80℃冰箱保存。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

電導(dǎo)率、丙二醛(MDA)含量的測(cè)定，電導(dǎo)率采用FE30型電導(dǎo)率儀測(cè)定[10]。硫代巴比妥酸法 (TBA) 進(jìn)行MDA含量測(cè)定[11]。

脯氨酸含量測(cè)定，采用磺基水楊酸法。

抗氧化酶活性測(cè)定。酶液提取，稱取0.5g植物材料放入研缽中，加5ml pH=7.8的磷酸緩沖液，冰浴研磨，勻漿倒入離心管中，10000轉(zhuǎn)/分鐘冷凍離心20分鐘，取上清液倒入試管中，置于0～4℃下保存待用(短期)。超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定，采用氮藍(lán)四唑光化還原法；過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法。

2 結(jié)果與分析

2.1 霜凍來(lái)臨前后溫度變化

圖1為4月2日中午12時(shí)至3日12時(shí)、5日中午12時(shí)至6日中午12時(shí)溫度變化情況，4月2日中午溫度最高達(dá)到30℃，并且白天溫度維持在25℃以上，3日凌晨最低溫16.6℃。5日17時(shí)至6日8時(shí)持續(xù)3小時(shí)低于0℃，最低溫度達(dá)到-1℃。

圖1 低溫前后溫度變化

2.2 不同處理的葡萄葉片受凍情況

低溫發(fā)生時(shí)新梢長(zhǎng)3～6cm，梢葉幼嫩，含水量較高，易受低溫凍害。此次降溫溫度回升后觀察發(fā)現(xiàn)，部分幼嫩葉片呈暗黑色，其中對(duì)照的梢尖葉片受害率達(dá)30.0%；噴施碧護(hù)的基本無(wú)外觀癥狀，噴施褪黑素的葉片受害率5.0%左右，噴施天達(dá)的葉片受害率15.0%左右。

2.3 不同處理對(duì)葡萄葉片相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛MDA含量的影響

在溫度逆境脅迫下活性物質(zhì)會(huì)大量積累，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞導(dǎo)致葉片的相對(duì)電導(dǎo)率升高。如圖2所示，對(duì)照葉片的相對(duì)電導(dǎo)率14.85%，噴碧護(hù)的比對(duì)照低26.0%，噴褪黑素的低20.9%，噴天達(dá)的低18.6%，均與對(duì)照差異顯著，但三者之間沒(méi)有顯著差異。噴施3種化學(xué)制劑有利于減輕細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞程度。

圖2 霜凍對(duì)葡萄葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物之一，其含量的多少可以反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度的高低。葡萄遭受低溫后MDA含量升高(圖3)，以對(duì)照葉片中的MDA含量最高，達(dá)到0.023μmol/g FW，噴碧護(hù)和天達(dá)的分別比其低84.4%、45.7%，噴褪黑素MT的低20.9%。

圖3霜凍對(duì)葡萄葉片丙二醛(MDA)含量的影響

2.4 不同處理對(duì)葡萄葉片脯氨酸含量的影響

葡萄植株遭受低溫脅迫后葉片的脯氨酸含量升高，如圖4所示，對(duì)照脯氨酸含量最高，為2.41μg/g FW；噴施天達(dá)的與對(duì)照無(wú)顯著性差異，噴褪黑素的為對(duì)照的92.5%，噴碧護(hù)的為對(duì)照的91.0%，且與其他兩個(gè)處理差異顯著，說(shuō)明輕微霜凍條件下噴碧護(hù)對(duì)葉片的脯氨酸含量有明顯穩(wěn)定作用。

圖4 低溫對(duì)葡萄葉片脯氨酸含量的影響

2.5 不同處理對(duì)葡萄葉片SOD、POD活性的影響

植物體內(nèi)有完善的清除活性氧的防衛(wèi)體系，能保證體內(nèi)活性氧處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。植株遭受逆境脅迫時(shí)體內(nèi)活性氧會(huì)積累。POD和SOD是植物抗氧化酶體系中重要的防御酶，可以有效清除積累的活性氧，減輕細(xì)胞遭受的損傷。如圖5，圖6可見(jiàn)，對(duì)照的SOD、POD活性分別為199.93U/min·g FW、3.17U/min·g FW，3個(gè)處理葉片的SOD、POD活性上升幅度均小于對(duì)照，其中SOD活性噴碧護(hù)為對(duì)照的65.8%，噴褪黑素為對(duì)照的69.3%，噴天達(dá)為對(duì)照的76.8%。3個(gè)處理對(duì)POD活性的影響有明顯差異，其中噴天達(dá)的是對(duì)照的81.2%，噴碧護(hù)的是對(duì)照的54.6%，而噴褪黑素的POD活性增加幅度最小，僅為對(duì)照的41.9%。說(shuō)明POD活性對(duì)褪黑素更加敏感。

圖5 葡萄遭受霜凍過(guò)后葉片SOD含量的變化

圖6 葡萄遭受霜凍過(guò)后葉片POD含量的變化

3 討論與結(jié)論

逆境溫度會(huì)使細(xì)胞內(nèi)活性氧積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，最終對(duì)植物造成傷害甚至死亡[12-16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在輕度低溫脅迫后葡萄幼葉的MDA含量明顯上升，相對(duì)電導(dǎo)率升高，噴布褪黑素、碧護(hù)、天達(dá)處理的MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率均顯著低于對(duì)照，說(shuō)明經(jīng)處理過(guò)后，減輕了葡萄葉片細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)了膜的完整性，減小電解質(zhì)的外滲，以碧護(hù)處理效果最明顯。

SOD是清除活性氧的主要酶類[17,18]，也是植物細(xì)胞防御系統(tǒng)中一個(gè)極為重要的保護(hù)酶類。POD可以使組織中所含有某種碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加抵抗寒冷的能力[19]。受到低溫傷害后未進(jìn)行任何處理的葡萄幼葉SOD和POD活性顯著高于3個(gè)處理，3種防霜物質(zhì)都明顯抑制這些指標(biāo)的上升。

有研究發(fā)現(xiàn)植物遭受逆境脅迫時(shí)其體內(nèi)的脯氨酸含量增加，有助于細(xì)胞或者組織保持一定的水分，從而使植物細(xì)胞的滲透勢(shì)下降，以提高抗低溫脅迫的能力[20]。發(fā)生低溫脅迫后對(duì)照的脯氨酸增加幅度明顯高于3個(gè)處理，褪黑素與碧護(hù)的反應(yīng)水平類似。

綜上所述，在-1℃低溫脅迫造成了葡萄幼葉的表觀傷害和膜脂過(guò)氧化，也調(diào)動(dòng)了各種抗氧化抗寒物質(zhì)的響應(yīng)[21]，導(dǎo)致脯氨酸含量、SOD、POD活性上升，而3種防霜物質(zhì)都明顯抑制了這些指標(biāo)的上升，說(shuō)明在輕度低溫脅迫下噴布這3種物質(zhì)使葡萄葉片受凍程度減輕，噴布外源褪黑素與生產(chǎn)上推薦使用的天達(dá)及碧護(hù)有類似效果，因此褪黑素作為一種強(qiáng)抗氧化劑對(duì)生態(tài)逆境的緩解作用值得進(jìn)一步研究探索。