朱戈麗 喻業(yè)安 陳晚先 張艷霞 封寶紅 伍 軍

百令膠囊、還原型谷胱甘肽臨床應(yīng)用，能減輕慢性腎臟病癥狀、緩解病情[1,2]，但該兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用治療慢性腎臟病的研究報(bào)道少見。本文通過制作單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型，采用HE、SPA及免疫組化染色方法，觀察百令膠囊與還原型谷胱甘肽聯(lián)合治療對(duì)UUO大鼠腎臟纖維化的影響及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組治療

清潔級(jí)SD大鼠28只，雄性，體重250—300g。隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=7)，實(shí)驗(yàn)大鼠只游離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎。UUO模型組(UUO組，n=7)，完全結(jié)扎左側(cè)輸尿管成模。百令膠囊治療組(n=7)，本組大鼠于制模前1天至術(shù)后第9天，每日給予百令膠囊聯(lián)合1.5 g/kg灌胃治療一次，制作方法同UUO組。百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱肽組(聯(lián)合治療組，n=7)，本組大鼠于制模前1天至術(shù)后第9天，每日給予百令膠囊1.5 g/kg及還原型谷胱甘肽300 mg/kg灌胃治療一次，制模方法同UUO組。百令膠囊購(gòu)于杭州中美華東制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字Z10910036)。

1.2 UUO模型制作方法

大鼠禁食水12h后， 3%戊巴比妥鈉溶液按0.5ml/100g腹腔注射麻醉；仰臥固定，去毛，消毒，于左側(cè)腹部稍偏下切開約2cm左右切口，逐層分離腹部組織直至腹腔，以左側(cè)髂血管為標(biāo)志，尋找到跨過左側(cè)髂血管的左側(cè)輸尿管，向上游離輸尿管直至左側(cè)腎盂。假手術(shù)組大鼠只游離輸尿管不結(jié)扎，余三組大鼠均游離輸尿管后使用0號(hào)絲線于左側(cè)輸尿管腎盂結(jié)合處以及向下1cm左右分別完全結(jié)扎，復(fù)位腸管，逐層縫合關(guān)閉腹腔。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

治療9天后，取術(shù)側(cè)腎組織，于腎臟正中沿垂直腎臟長(zhǎng)軸切取數(shù)塊約1—2mm厚腎組織，10%福爾馬林溶液固定后，常規(guī)取材，檢測(cè)以下內(nèi)容。所用主要試劑：一抗分別為TGF-β1抗體、Lollagen抗體，均購(gòu)自武漢博士德生物有限公司； BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自碧云天公司；HFP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德有限公司； ECL底物，購(gòu)自Thermo公司；顯影定影試劑，購(gòu)自天津漢中攝影材料廠。

1.3.1腎臟組織病理觀察：取10%福爾馬林固定的腎組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋、切片，常規(guī)方法HE和PAS染色，PAS染色糖原呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，光鏡下觀察各組腎小管間質(zhì)病變。

1.3.2腎臟組織纖維化：取上述石蠟切片，常規(guī)方法Masson染色，染色纖維呈藍(lán)色，光鏡下觀察腎臟組織纖維化。

1.3.3免疫組化染色檢測(cè)I型膠原蛋白、TGF-β1和a-SMA表達(dá)：取上述石蠟切片，常規(guī)方法脫蠟，0.01M枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。正常山羊血清封閉液室溫封閉30min。分別滴加不同的一抗，4℃濕盒中孵育15h。滴加山羊抗兔/小鼠二抗，37℃孵育20min。最后加入DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間。蘇木素復(fù)染。脫水，封片。采用PBS緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性染色為棕色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組腎臟組織病理學(xué)變化比較

HE和PAS染色顯示：假手術(shù)組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小管排列整齊、緊密，腎小管基底膜光滑，間質(zhì)內(nèi)無炎癥細(xì)胞侵染。UUO組大鼠腎小管部分上皮細(xì)胞空泡變性，部分管腔擴(kuò)張，腎小管基底膜彌漫性增厚，可見間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。百令膠囊治療組，腎小管結(jié)構(gòu)較為完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，但仍見部分腎小管管腔擴(kuò)張。聯(lián)合治療組腎小管結(jié)構(gòu)較完整、排列整齊，未見明顯管腔擴(kuò)張和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1、圖2。

2.2 各組腎臟組織纖維化比較

Masson染色后組織纖維呈藍(lán)色。結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腎臟組織未見明顯纖維化。UUO組，大鼠腎臟組織纖維化嚴(yán)重。百令膠囊治療組和聯(lián)合治療組大鼠纖維化明顯減輕，聯(lián)合治療組效果更明顯。見圖3。

2.3 各組免疫組化指標(biāo)比較

2.3.1I型膠原蛋白：假手術(shù)組腎間質(zhì)I型膠原蛋白陽(yáng)性(棕色)染色較弱，即I型膠原蛋白表達(dá)較少。UUO組可見腎間質(zhì)I型膠原蛋白呈棕色強(qiáng)陽(yáng)性染色，即I型膠原蛋白表達(dá)增加。百令膠囊或百令膠囊聯(lián)合谷胱甘肽治療后，大鼠腎間質(zhì)I型膠原蛋白陽(yáng)性染色減弱， I型膠原蛋白表達(dá)減少，聯(lián)合治療組效果較百令膠囊治療組更少。見圖4。

2.3.2TGF-β1表達(dá)：假手術(shù)組TGF-β1蛋白染色不明顯，UUO組可見TGF-β1蛋白強(qiáng)陽(yáng)性(棕色)染色。百令膠囊治療組和聯(lián)合治療組， TGF-β1蛋白陽(yáng)性染色減弱，聯(lián)合治療組陽(yáng)性染色更少。見圖5。

2.3.3a-SMA表達(dá)：假手術(shù)組動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)a-SMA，腎間質(zhì)未見a-SMA表達(dá)。UUO組腎間質(zhì)a-SMA蛋白陽(yáng)性染色(棕色)明顯，即a-SMA蛋白表達(dá)增加。百令膠囊治療組腎間質(zhì)a-SMA蛋白陽(yáng)性染色減弱， a-SMA蛋白表達(dá)減少，聯(lián)合治療組較百令膠囊治療組更少。見圖6。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化(HE染色，×200)

圖2 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化(SPA染色，×200)

圖3 各組大鼠腎臟組織纖維化 (Masson染色，×200)

圖4 各組大鼠腎臟組織I型膠原蛋白表達(dá)(免疫組化染色，×200)

圖5 各組大鼠腎臟TGF-β1蛋白表達(dá)(免疫組化染色，×200)

圖6 各組大鼠腎臟組織a-SMA蛋白表達(dá)(免疫組化染色，×200)

3 討 論

腎臟纖維化是所有慢性腎臟病進(jìn)展至終末期腎病的一種病理?yè)p傷過程。腎臟纖維化形成主要涉及以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：(1)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；(2)腎臟固有細(xì)胞損傷、活化，細(xì)胞增殖與凋亡，以及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化；(3)促炎癥因子的異常分泌；(4)細(xì)胞外基質(zhì)異常積聚；(5)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生與降解功能失調(diào)等，造成大量細(xì)胞外基質(zhì)在腎臟內(nèi)沉積，導(dǎo)致腎小球硬化、足細(xì)胞丟失，腎小管及間質(zhì)毛細(xì)血管減少，腎小管萎縮，完整的腎單位逐漸減少直至消失[3]。因此，改善腎臟纖維化是治療慢性腎臟病的重要環(huán)節(jié)。

目前臨床上常用的純中藥制劑百令膠囊(杭州中美華東制藥有限公司，規(guī)格0.5g)，主要成分是D-甘露醇、蟲草酸、載體生物堿、19種氨基酸、多種維生素及微量元素，具有補(bǔ)肺腎、益精氣的作用[4]。注射用還原型谷胱甘肽(重慶藥友制藥有限公司，商品名：阿拓英蘭，規(guī)格：0.9g/支)，活性成分為還原型谷胱甘肽,廣泛分布于人類肝細(xì)胞和腎細(xì)胞,參與體內(nèi)氧化還原過程,與過氧化物及自由基結(jié)合,組成機(jī)體的抗氧化系統(tǒng),清除各種氧和自由基[5，6]。兩者聯(lián)合應(yīng)用于慢性腎臟病患者，可能起到協(xié)同治療的作用，增強(qiáng)兩藥臨床治療效果。本研究顯示，UUO 大鼠發(fā)生明顯腎間質(zhì)纖維化病理改變。通過百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽治療，明顯改善和減輕UUO大鼠的腎小管基底膜增厚和腎臟組織纖維化。

腎間質(zhì)纖維化的膠原成分主要為Ⅰ 、Ⅲ型膠原，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，在慢性腎臟病過程中發(fā)揮重要作用[7，8]。TGF-β1是纖維化過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子, 能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，參與腎間質(zhì)纖維化過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)[9]。而a-SMA作為肌成纖維細(xì)胞的表面標(biāo)志,正常的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞并不表達(dá)，但病理狀態(tài)下，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，均表達(dá)a-SMA[10]。本研究通過對(duì)大鼠腎組織進(jìn)行Masson檢測(cè)、免疫組化檢測(cè)，結(jié)果均表明百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽治療UUO，可以阻止腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，抑制a-SMA表達(dá)，減少膠原及細(xì)胞外基質(zhì)合成，且效果優(yōu)于百令膠囊治療組。說明百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽，具有明顯抗腎間質(zhì)纖維化作用。

綜上所述，百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽治療，可能抑制I型膠原蛋白和TGF-β1蛋白高表達(dá)，減少成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而改善腎間質(zhì)纖維化。提示臨床兩藥聯(lián)用，以加強(qiáng)改善患者臨床癥狀，提高對(duì)慢性腎臟病患者療效。