李善華 張 薇

卵巢癌為婦科常見惡性腫瘤，發(fā)病率居婦科腫瘤中第三位，死亡率居第一位，給患者身體健康造成嚴(yán)重威脅[1]。該病起病隱匿，早期缺乏明顯臨床癥狀，易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，患者5年內(nèi)生存率不足40%[2]。探究卵巢癌的發(fā)病機制對于該病的靶向治療具有十分積極的意義。卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移涉及多因素、多基因共同參與，染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白-1(Chromodomain Helicase/ATP DNA Binding Protein 1-Like Gene，CHD1L)在多種腫瘤中如肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌中均呈高表達[3-5]，且與癌細胞的增殖、侵襲和遷移有關(guān)，然而其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用目前尚不明確。本研究通過將siRNA干擾CHD1L轉(zhuǎn)染至卵巢癌細胞，觀察其對卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響并分析其可能的作用機制，以期為卵巢癌的靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

高轉(zhuǎn)移卵巢癌細胞株HO-8910PM購于中科院上海細胞生物研究所，在含有5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每隔3天進行傳代培養(yǎng)一次，細胞培養(yǎng)3代后消化細胞，PBS溶液清洗，離心后保留下層細胞，備后續(xù)研究。

1.2 試劑與藥品

胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶購于杭州四季青有限公司；青霉素、鏈霉素購于美國Gibco公司；siRNA-CHD1L質(zhì)粒購于上海吉瑪公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo公司；qRT-PCR檢測試劑盒購于日本Takara公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、DMEM培養(yǎng)基購自于碧云天公司；DMSO購于美國Sigma公司；辣根過氧化物酶(Horse Radish Peroxidase，HRP)山羊抗兔IgG二抗購自于美國Amresco公司；TRIzol試劑、NF-κB、MMP-2、MMP-9一抗購自于美國R&D公司；結(jié)晶紫染液購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡購于Olympus公司；酶標(biāo)儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司；流式細胞儀購于美國Becton,Dickinson 公司；凝膠圖像分析儀購于英國Alpha公司。Transwell小室購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司(24孔，孔徑3μm)；PCR擴增儀購自美國ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1小干擾RNA(Small Interference RNA，siRNA)的合成：從GenBank中獲取人CHD1L基因序列，根據(jù)siRNA設(shè)計原則，設(shè)計靶向CHD1L的siRNA序列，同時設(shè)定陰性對照(si-NC)序列,見表1。

微循環(huán)學(xué) 雜志2019年第29卷第1期基礎(chǔ)與實驗 ?

1.3.2細胞轉(zhuǎn)染：收集對數(shù)生長期HO-8910PM細胞，用0.25%胰酶溶液消化后制備單細胞懸浮液，將細胞密度調(diào)整為1×106個/孔接種于六孔板，添加細胞培養(yǎng)液充分混勻后，放置在5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待細胞融合度達到80%-90%時，更換無FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)1h，參照 Lipofectamine 2000試劑盒轉(zhuǎn)染，將si-NC組、si-CHD1L質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HO-8910PM細胞培養(yǎng)，命名為si-NC、si-CHD1L組，同時設(shè)定以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞作為空白對照組(對照組)，每組均設(shè)定6個重復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后添加無FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)6—8h，隨后更換為含F(xiàn)BS培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細胞，進行后續(xù)檢測。

1.3.3實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細胞CHD1L mRNA表達：用TRIzol法提取轉(zhuǎn)染后細胞總RNA，測定濃度以及純度后，根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，CHD1L上游引物：5’-TTG GTG GTG AAT ATG AAA GG-3’，下游引物：5’-TAA GAG TCG TTG GCG AGT-3’；GAPDH：上游引物：5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，下游引物：5’-ATG GTG GTG AAG ACG CCA GT-3’；反應(yīng)體系：TaqDNA 聚合酶1μl，上、下游引物各2μl，cDNA 1μl，緩沖液10μl，10mM dNTP 1μl，ddH2O 33μl；反應(yīng)條件：預(yù)變性：95℃ 5min，變性：95℃ 30s，延伸：62℃ 15s，共35個循環(huán)，每個樣本均設(shè)定3個重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后利用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，以GAPDH為內(nèi)參分析CHD1L mRNA相對表達量。

1.3.4CCK-8法檢測細胞增殖情況：分別收集轉(zhuǎn)染后細胞，將細胞濃度調(diào)整為1×104個/ml接種細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24，36，48，72h后每孔內(nèi)添加CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，收集細胞，添加150μl DMSO溶液混勻后靜置5min，酶標(biāo)儀檢測450nm波長下各組細胞吸光度值(OD)，計算si-CHD1L對細胞生長的抑制。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD/Control組OD)×100%。每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。

1.3.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力：收集細胞，將細胞濃度調(diào)整為1×104個細胞在細胞培養(yǎng)皿中，將細胞放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)后更換新鮮培養(yǎng)基，移液槍槍頭蘸取細胞培養(yǎng)液在培養(yǎng)基表面劃長約2cm的痕跡，培養(yǎng)48h后置于顯微鏡下觀察細胞遷移變化。

1.3.6Transwell小室系統(tǒng)檢測細胞遷移、侵襲：采用Transwell小室測定細胞遷移和侵襲，收集細胞后密度調(diào)整為1×105個/ml，上室中加入不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基并接種細胞，同時將含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基添加至下室。37℃孵育24h后，去除在膜表面殘留細胞，無水甲醇室溫固定30min，添加0.1%結(jié)晶紫染液對膜染色，置于顯微鏡下統(tǒng)計細胞遷移數(shù)量。進行侵襲實驗時，用Matrigel預(yù)涂上室風(fēng)干，其余步驟同遷移實驗。

1.3.7蛋白免疫印跡(Western Blot，WB)檢測相關(guān)蛋白表達：收集轉(zhuǎn)染后細胞消化后添加RIPA細胞裂解液冰上放置30min，離心后收集上清，采用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，蛋白上樣量統(tǒng)一為20μg，SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PDVF膜上，4℃中行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，脫脂牛奶封閉后加入MMP-2、MMP-9、NF-κB一抗稀釋液(1∶500)，4℃孵育過夜添加二抗稀釋液，37℃孵育2h，ECL曝光顯影后，以β-actin表達作為內(nèi)參蛋白，置于凝膠成像系統(tǒng)中評估蛋白表達水平。以目的蛋白與β-actin蛋白條帶灰度比值代表該指標(biāo)的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 siRNA沉默CHD1L后CHD1L mRNA表達

各組CHD1L mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=37.281，P<0.05)。與對照組和si-NC組比較，si-CHD1L組細胞CHD1L mRNA表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q均>10.344，P<0.05)。

表2 HO-8910PM細胞中CHD1L mRNA表達

2.2 siRNA沉默CHD1L對HO-8910PM細胞增殖能力的影響

各組各時點HO-8910PM細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，si-NC組各時間點細胞增殖抑制率無明顯變化(q均<0.085，P>0.05)，si-CHD1L組細胞增殖抑制率較對照組和si-NC組均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q均>25.920，P<0.05)。

表3 siRNA沉默CHD1L對細胞增殖抑制率的影響

2.3 siRNA沉默CHD1L對HO-8910PM細胞遷移能力的影響

劃痕實驗顯示，培養(yǎng)48h后，各組細胞劃痕間距差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，si-NC組HO-8910PM細胞遷移能力無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q=1.125，P>0.05)，si-CHD1L組HO-8910PM細胞遷移能力較對照組和si-NC組均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(q均>13.680，P<0.05)，見圖1、表4。

圖1 劃痕實驗檢測HO-8910PM細胞遷移能力

表4 各組HO-8910PM細胞間劃痕間距的比較

2.4 siRNA沉默CHD1L對HO-8910PM細胞遷移、侵襲數(shù)量的影響

各組細胞遷移、侵襲細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，si-NC組HO-8910PM細胞遷移、侵襲數(shù)量無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q均<1.260，P>0.05)，si-CHD1L組HO-8910PM細胞遷移、侵襲數(shù)量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(q均>8.410，P<0.05)。

圖2 Transwell小室檢測HO-8910PM細胞遷移、侵襲能力

表5 各組HO-8910PM細胞遷移、侵襲能力比較個，n=6)

2.5 siRNA沉默CHD1L對HO-8910PM細胞NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

各組NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，si-NC組NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表達無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q均<1.200，P>0.05)，si-CHD1L組NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(q均>12.450，P<0.05)。

圖3 WB檢測NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表達

表6 各組NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較

3 討 論

卵巢癌患者易發(fā)生局部侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，使侵潤組織和已發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織難以完全清除，進而影響手術(shù)治療效果[6]。雖然近年來卵巢癌手術(shù)治療已取得較大完善和進步，但卵巢癌仍是威脅婦女生命健康的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)研究顯示，卵巢癌患者的5年存活率不足40%[7]。腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移為一個多步驟、多階段、多基因參與的復(fù)雜的生物過程,探討卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移基因?qū)﹃U明卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制以及尋找治療靶標(biāo)具有十分重要的意義。

CHD1L位于人染色體1q21區(qū),屬于SNF2類家族,在轉(zhuǎn)錄、蛋白-DNA結(jié)合等方面發(fā)揮十分重要的調(diào)控作用。CHD1L為SNF2-類亞家族成員中唯一一個致癌基因[8]。Chen等[9]研究顯示CHD1L長期高水平表達能夠促進腫瘤細胞增殖，加速惡性腫瘤的形成。Hu等[10]研究發(fā)現(xiàn)CHD1L與腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過激活細胞肌動蛋白絲的形成，加速細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程，進而促進腫瘤細胞的侵襲、遷移。Su 等[11]研究發(fā)現(xiàn)CHD1L蛋白在胃癌患者組織中高表達，其表達水平與遠處轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)，且高表達者預(yù)后較差。乳腺癌患者CHD1L呈高表達，其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且可激活m TOR/MMP通路提高細胞的侵襲、遷移能力[12]。在小鼠的體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，抑制CHD1L表達后，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯降低，小鼠生存期明顯延長[13]。Ji 等在肝細胞癌中發(fā)現(xiàn)，過表達CHD1L可影響小鼠肝細胞癌進展，如可促進細胞增殖、粘附、遷移等[14]。本研究顯示siRNA干擾CHD1L后HO-8910PM細胞增殖、侵襲、遷移能力均明顯降低，提示CHD1L可能為調(diào)控卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移的重要因子。

NF-κB屬于重要核轉(zhuǎn)錄因子，在未受到外界刺激情況下，其與抑制物結(jié)合以未激活狀態(tài)存于細胞質(zhì)內(nèi)，在細胞受到外界刺激、損傷后，抑制物發(fā)生磷酸化且降解后，使NF-κB轉(zhuǎn)移至細胞核中，調(diào)控細胞因子、黏附、趨化因子轉(zhuǎn)錄，進而參與腫瘤細胞的增殖、遷侵襲、轉(zhuǎn)移過程[15,16]。研究顯示NF-κB在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。辛伐他汀可通過抑制NF-κB通路降低人高轉(zhuǎn)移卵巢癌HO-8910PM細胞遷移、侵襲[17]。川楝素可通過抑制人卵巢癌細胞NF-κB和上皮型鈣黏蛋白的表達，影響細胞侵襲和遷移能力[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，siRNA沉默CHD1L后可明顯降低NF-κB蛋白表達，提示CHD1L抑制后可能通過調(diào)控NF-κB表達，抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移能力。

MMP能夠降解細胞外基質(zhì)，在癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。范從紅等人研究表明，上調(diào)卵巢癌細胞中MMP-2的表達水平可提高卵巢癌細胞的侵襲、遷移能力[19]。氯化尼替丁通過ERK信號通路抑制MMP-2/9的產(chǎn)生，抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲，表明MMP-2/9與卵巢癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，siRNA沉默CHD1L后細胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平明顯降低，提示沉默CHD1L后可能通過降低MMP-2、MMP-9的表達水平抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，siRNA沉默CHD1L后顯著抑制卵巢癌HO-8910PM細胞增殖、侵襲、遷移增殖，可能是通過抑制NF-κB，下調(diào)MMP-2、MMP-9相關(guān)蛋白發(fā)揮作用。然而NF-κB作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵因子，涉及到多種蛋白表達調(diào)控，其過程十分復(fù)雜，具體的作用機制尚需深入研究。