鄭紅云 申復(fù)進(jìn) 童永清 王海博 李 艷，#

蛋白磷酸酶2A(Protein Phosphatase 2A，PP2A)是真核牛物體內(nèi)主要的Ser/Thr蛋白磷酸酶，能使蛋白質(zhì)脫磷酸，在細(xì)胞代謝、分化、增殖、凋亡及細(xì)胞轉(zhuǎn)化等生理過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。人類許多腫瘤中PP2A相關(guān)亞基的活性顯著下調(diào)[2]，而抑制PP2A亞基活性則可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。研究報(bào)道抑制PP2A活性可通過(guò)抑制Wnt信號(hào)途徑顯著促進(jìn)人類結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]，而c-MYC激活PP2A活性則可明顯抑制乳腺癌的發(fā)生[4]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，PP2A是最重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶，可廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種信號(hào)途徑[5]。MAPK信號(hào)途徑廣泛地調(diào)控一系列細(xì)胞活動(dòng)，包括增殖、分化發(fā)育、遷移、凋亡等[6]。在MAPK家族中，研究最廣泛三條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和絲裂原活化蛋白激酶p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[7]，而PP2A可參與調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)途徑。

本課題前期結(jié)果表明PP2A在宮頸癌患者的血清學(xué)和腫瘤組織水平顯著下調(diào)[7，8]，提示PP2A可能參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究擬在細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)一步研究PP2A影響宮頸癌細(xì)胞侵襲的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、試劑和儀器

1.1.1Hela細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng)：Hela細(xì)胞系購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)。采用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基[加10%胎牛血清(FBS)和100單位的青鏈霉素]，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞2-3天換液一次，當(dāng)細(xì)胞豐度達(dá)到80%左右時(shí)，棄舊的培養(yǎng)基，0.25%胰酶消化細(xì)胞5min，去掉胰酶，再加入新鮮的完全培養(yǎng)基，吸管吹打細(xì)胞，混勻，傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2質(zhì)粒：野生型PP2AC (wtPP2Ac)和干擾PP2Ac(siPP2A)質(zhì)粒均由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供[9]。

1.1.3主要試劑和儀器：進(jìn)口胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gbico公司；DMEM、OPTI-MEM與Lipofectamine 2000均從Invitrogen公司購(gòu)買；RPMI 1640 購(gòu)自HyClone公司；氨芐青霉素和卡那霉素從TaKaRa Biotechllology公司購(gòu)買；岡田酸(Okdaic Acid，OA)、D-erythro-Sphingosine(DES)購(gòu)自CalBiochem公司。CO2培養(yǎng)箱(Heal force,hf151uv，上海力康)；倒置顯微鏡(Olympus，日本)；高壓蒸氣滅菌器(Hirayama，日本)；臺(tái)式高速離心機(jī)(Sigma公司)；恒溫水溶箱(武漢科技儀器廠)；普通倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)；雙光子共聚焦顯微鏡(LSM510 Carl Zeiss，德國(guó))。

1.2 細(xì)胞分組及處理

1.2.1藥物干擾實(shí)驗(yàn)：共分為3組，對(duì)照組(常規(guī)方法培養(yǎng)的Hela細(xì)胞，n=6)、DES組(細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10mM PP2A激動(dòng)劑DES，n=6)和OA組(細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10mM PP2A抑制劑OA，n=6)。

1.2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：共分為3組，對(duì)照組(DsRed組，n=6)、wtPP2A組(n=6)和siPP2A組(n=6)，每組轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒DNA 0.8μg，具體操作如下：50μl的 Opti-MEM 培養(yǎng)基中加入質(zhì)粒DNA 0.8μg；另一50μl Opti-MEM 培養(yǎng)基中加入 2μl Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，超凈臺(tái)內(nèi)靜置 5min 后將兩者混合混勻，超凈臺(tái)內(nèi)室溫孵育25min; 將 100μl DNA與脂質(zhì)體復(fù)合物直接加入培養(yǎng)孔，迅速置于37℃培養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo)和方法

1.3.1細(xì)胞遷移率：利用小室穿孔實(shí)驗(yàn)觀察PP2A對(duì)Hela細(xì)胞遷移能力的影響。在小室下層加入含10% FBS的DMEM/F12(作為趨化劑)，小室上層是含1% FBS的DMEM/F12，將藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞種植于小室上層，細(xì)胞在趨化劑的作用下從上層往下層遷移，發(fā)生遷移的細(xì)胞粘附在膜的下層，6h后固定照相分析結(jié)果，細(xì)胞遷移率=小室膜下層細(xì)胞數(shù)/(小室膜上層細(xì)胞數(shù)+小室膜下層細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.2細(xì)胞侵襲率：采用小室穿孔實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲率。事先將小室的半透明聚碳酯膜用PDL包被，小室放在一個(gè)24孔板內(nèi)紫外照射，然后放置37℃培養(yǎng)箱備用。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒48h后經(jīng)胰酶消化，重懸于含血清1%FBS的DMEM/F12中(0.5ml 的DMEM/F12中細(xì)胞為5×104個(gè))加入小室上層。在紫外照射滅菌過(guò)夜的小室的小孔下層中加入0.75ml含10%FBS的RPMI 1640，將孔徑為8μm的半透明聚碳酯膜覆蓋；載有小室的12孔板在培養(yǎng)箱中放置6h后取出，將膜置于4% PFA中固定15min后，因質(zhì)粒帶有熒光，在激光共聚焦顯微鏡上觀察膜上在孔中的細(xì)胞總數(shù)，拍照并計(jì)數(shù)；用棉簽將上層未發(fā)生侵襲的細(xì)胞刮去，觀察膜下層未發(fā)生侵襲的細(xì)胞，共聚焦顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)膜上層和膜下層的細(xì)胞，膜上層細(xì)胞加上膜下層細(xì)胞為細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞侵襲率=膜下層細(xì)胞/(膜上層細(xì)胞+膜下層細(xì)胞)×100%。

經(jīng)過(guò)治療后,觀察組有20例有效,臨床治療有效率是95.24%,對(duì)照組有14例有效,臨床治療有效率是66.67%,對(duì)兩組的一般性資料對(duì)比不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P<0.05)。

1.3.3相關(guān)蛋白檢測(cè)：采用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)檢測(cè)MAPK家族中JNK、p38、ERK及其相應(yīng)的磷酸化水平以及基質(zhì)金屬酶9(MMP-9)水平。藥物干擾實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞經(jīng)藥物處理48h后分離細(xì)胞，蛋白提取后BCA試劑盒測(cè)定進(jìn)行蛋白定量。樣品加入相應(yīng)體積溴酚藍(lán)(終濃度0.2%)和β-ME (終濃度10%)，在振蕩器上振蕩20s，置水浴鍋中水浴煮沸5—10min，煮沸后可以適當(dāng)?shù)退俣虝弘x心以防蛋白掛在EP管壁上。用微量加樣器取樣品加入各個(gè)泳道，加樣體積視不同組蛋白含量而定，以保證各組加樣蛋白總量一致。加樣后先用恒流(10mA/膠)電泳，待溴酚藍(lán)指示劑電泳至濃縮膠(4%)與分離膠(10%)交界處成以線狀時(shí)，改為恒壓(100V)電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。然后將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至NC或PVDF膜(提前用甲醇浸泡)上，275mA轉(zhuǎn)移1h。孵育抗體及顯色：蛋白轉(zhuǎn)移印跡到NC或PVDF膜上，印跡有蛋白的NC或PVDF膜在室溫下以5%脫脂牛奶封閉1h，與相應(yīng)一抗在4℃孵育過(guò)夜，TBS-Tween 20 緩沖液洗膜3次，每次10min，與帶辣根過(guò)氧化物酶的二抗在室溫孵育1h，TBS-T緩沖液洗膜3次，每次10min，最后信號(hào)用ECL系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。以β-actin為內(nèi)參照，目的蛋白與β-actin蛋白條帶灰度比值為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PP2A對(duì)體外藥物干擾實(shí)驗(yàn)組Hela細(xì)胞遷移的影響

如圖1所示，藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)各組Hela細(xì)胞遷移率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=382.11，P<0.01)。與對(duì)照組比較，DES組Hela細(xì)胞遷移率明顯降低(24.17%±1.47% vs 14.58%±1.12%，t=12.72，P<0.01)，OA組Hela細(xì)胞遷移率明顯明顯增加(24.17%±1.47% vs 37.75%±1.73%，t=-14.67，P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.2 PP2A對(duì)體外質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組Hela細(xì)胞侵襲的影響

如圖2所示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)各組Hela細(xì)胞侵襲率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=165.82，P<0.01)。與DsRed組比較，wtPP2A組細(xì)胞侵襲率明顯降低(23.89%±0.95% vs 12.33%±0.82%，t=17.22，P<0.01)，siPP2A組Hela細(xì)胞侵襲率明顯明顯增加(23.89%±0.95% vs 44.50%±5.10%，t=-9.40，P<0.01)。

2.3 體外藥物干擾實(shí)驗(yàn)組Hela細(xì)胞JNK、p38、ERK蛋白及其相應(yīng)的磷酸化水平以及MMP-9蛋白質(zhì)水平比較

對(duì)照組、DES組和OA組各種蛋白總蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F均<1.00，P>0.05)，而磷酸化水平及MMP-9蛋白質(zhì)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F均>610.02，P<0.01)。與對(duì)照組比較，DES組p-JNK (圖3A, E)、p-p38(圖3B, F)和p-ERK水平(圖3C, G)以及MMP-9水平(圖3D, H)均明顯下調(diào)(t均>24.20 ，P<0.01)，而OA組p-JNK (圖3A, E)、p-p38(圖3B, F)和p-ERK水平(圖3C, G)及MMP-9水平(圖3D, H)均明顯升高(t均>10.08，P<0.01)。

注：與DsRed組比較，*P<0.01

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特征。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的高低與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、粘連性和侵襲性以及新生血管的生成等諸多因素均密切相關(guān)。許多高度轉(zhuǎn)移能力的惡性腫瘤細(xì)胞都具有很強(qiáng)的遷移和侵襲能力。因而，腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提，腫瘤細(xì)胞遷移突破基底膜是該過(guò)程的主要標(biāo)志。

研究指出多種蛋白磷酸激酶在腫瘤的遷移和侵襲中起作用。隨著分子診斷與個(gè)體化醫(yī)療研究的飛速發(fā)展，多種以激酶作為作用靶點(diǎn)的靶向藥物己經(jīng)開(kāi)始研發(fā)，有些甚至已經(jīng)作為腫瘤靶向治療的一線用藥正式投入臨床使用[9]。目前研究結(jié)果表明許多激酶參與了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。如成簇黏附激酶(FAK)[10]、Src[11]、Crk[12]、磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)、絲裂原活化蛋白激酶MAPKs[13]及蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2[14]等均調(diào)節(jié)了細(xì)胞的遷移過(guò)程。絲裂原活化蛋白激酶激酶4(MAP2K4) 通過(guò)提高M(jìn)MP-2表達(dá)促進(jìn)人類前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[15]. GABRP可激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2)刺激乳腺癌細(xì)胞的遷移[16]. 進(jìn)一步研究報(bào)道，MAPK和PI3K/Akt 信號(hào)途徑亦參與了卵巢癌的細(xì)胞遷移過(guò)程[17].隨著藥物研究的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)激酶涉及的基因種類繁多，卻無(wú)法在一個(gè)基因?qū)用娼鉀Q問(wèn)題，于是尋找真正起決定作用的藥物靶點(diǎn)顯得尤為緊迫。雖然大量蛋白磷酸激酶參與了細(xì)胞遷移過(guò)程，但蛋白磷酸酯酶的作用仍然是保持細(xì)胞動(dòng)態(tài)循環(huán)過(guò)程的關(guān)鍵分子。

PP2A是最重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶，PP2A可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化。PP2A由結(jié)構(gòu)亞單位A(65kD)、調(diào)節(jié)亞單位B(50-130kD)和催化亞單位C(36 kD)構(gòu)成的異三聚體。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在小鼠的肺癌細(xì)胞(LLC)和人的鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(HNSCC)中，當(dāng)用PP2A 激活劑提高PP2A活性時(shí)，細(xì)胞穿越基底膜的能力下降，而用PP2A抑制劑抑制PP2A 活性時(shí)，細(xì)胞穿越基底膜的能力增強(qiáng)。在人類許多的腫瘤中，PP2A相關(guān)亞基的活性顯著下調(diào)，而抑制PP2A亞基活性則可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。與此同時(shí)，研究也相繼報(bào)道了磷酸酶和樹(shù)脂同源酯酶 (PTEN)[18], Src同源2的蛋白酪氨酸磷酸酶-2[19], 蛋白酪氨酸酯酶α[20]也被報(bào)道參與了細(xì)胞的遷移，但蛋白磷酸酯酶PP2A參與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲的研究相對(duì)較少。抑制PP2A可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)途徑起抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，而激活PP2A則可通過(guò)調(diào)節(jié)金屬蛋白酶2和9起促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[21]。

有文獻(xiàn)報(bào)道EphB3通過(guò)PP2A/RACK1/Akt信號(hào)途徑抑制非小細(xì)胞肺癌的遷移[22]。雖然以上大量細(xì)胞學(xué)水平的研究已經(jīng)表明，抑制PP2A可促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，但是PP2A對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲影響的機(jī)制研究并不清楚。本研究將選取過(guò)去從未報(bào)道的宮頸癌為研究對(duì)象，從血清和細(xì)胞水平共同探討PP2A在宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用及其可能機(jī)制。

本課題研究結(jié)果顯示激活PP2A活性可明顯抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲，而抑制PP2A活性則顯著促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲。進(jìn)一步研究其作用的可能機(jī)制意義重大。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌病人的血清中PP2A水平明顯下調(diào)，宮頸癌組織無(wú)論是mRNA還是蛋白質(zhì)水平均顯著下調(diào)，這提示PP2A水平下調(diào)可能參與宮頸癌細(xì)胞的侵襲。進(jìn)一步在宮頸癌細(xì)胞水平，我們通過(guò)藥物和基因手段分別調(diào)節(jié)PP2A活性，采用小室穿孔實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)激活PP2A可明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲，而抑制其活性后則明顯促進(jìn)細(xì)胞侵襲。該研究結(jié)果表明PP2A在宮頸癌的侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用。該研究結(jié)果提示PP2A可能是一個(gè)良好的抗腫瘤因子。

MAPK家族在不同細(xì)胞的遷移中發(fā)揮重要的作用，如ERK1/2促進(jìn)成纖維細(xì)胞、癌癥細(xì)胞、大鼠膠質(zhì)細(xì)胞的遷移。在人的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，抑制ERK1/2的磷酸化可延緩細(xì)胞的遷移。激活p38MAPK也可促進(jìn)很多細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞[23]、主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞[24]、角膜上皮細(xì)胞[25]等的遷移。在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤侵蝕正常組織和開(kāi)始轉(zhuǎn)移的重要途徑。細(xì)胞外基質(zhì)的降解主要依靠蛋白水解酶，這些蛋白水解酶主要分為4類，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)是其中較為重要的一類。MMP-9是MMPs家族中的重要一員。大量研究表明，MMP-9在多種惡性腫瘤中呈過(guò)度表達(dá)，降解破壞細(xì)胞外基質(zhì)中最主要的組份IV型、V型膠原和明膠。本課題的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PP2A可同時(shí)通過(guò)去磷酸化p-JNK, p-p38和p-ERKMAPK和下調(diào)金屬蛋白酶MMP-9起抑制宮頸癌腫瘤細(xì)胞的作用，這與以上的相關(guān)研究報(bào)道觀點(diǎn)一致。

綜上，本研究表明PP2A可能為宮頸癌的良好抗腫瘤因子。抑制PP2A可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲，從而延緩宮頸癌的發(fā)展。該研究將為宮頸癌的發(fā)生發(fā)展提供新的分子機(jī)制，同時(shí)也為臨床宮頸癌的個(gè)體化醫(yī)療提供新的藥物靶點(diǎn)。