陳小青 張銀依 付燕 王姍姍 李冰 劉漢偉 馬中春 虞維娜

【摘要】目的：建立稀有鮈鯽魚熱休克蛋白HSP70提取方法，進(jìn)行雙向電泳技術(shù)、western blot分析，為構(gòu)建稀有鮈鯽魚的蛋白質(zhì)分析提供了科學(xué)依據(jù)。方法：提取稀有鮈鯽魚的熱休克蛋白HSP70，采用雙向電泳技術(shù)、western blot技術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果：樣本里面HSP 70有兩種等電點(diǎn)，約5和7左右，且片段大小主要位于50-100之間。結(jié)論：本研究獲得了非常有價(jià)值的稀有鮈鯽魚的熱休克蛋白HSP70多態(tài)性分析結(jié)果，為構(gòu)建稀有鮈鯽魚的蛋白質(zhì)分析提供了科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】稀有鮈鯽;熱休克蛋白;HSP70;多態(tài)性分析

【中圖分類號(hào)】R181.3+2【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1005-0019（2019）04-198-02

由于在應(yīng)激反應(yīng)中的敏感性以及其功能的多樣性，熱休克蛋白已成為引人注意的藥物靶點(diǎn)，其中HSP70是目前研究最多的熱休克蛋白。特別是HSP70的高表達(dá)可以緩解細(xì)胞受到的損傷，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)應(yīng)激的抵抗力，同時(shí)HSP70在抗細(xì)胞凋亡、抗氧化、抗病毒及免疫等多方面起著重要的作用 [1]。稀有鮈鯽是我國(guó)境內(nèi)特有的一種新的魚類實(shí)驗(yàn)生物，對(duì)重金屬、農(nóng)藥等非常敏感，是環(huán)境生態(tài)毒性試驗(yàn)理想試驗(yàn)用魚[2]。但稀有鮈鯽魚熱休克蛋白HSP70多態(tài)性方面的研究尚未見公開報(bào)道。本研究建立了稀有鮈鯽魚熱休克蛋白HSP70多態(tài)性分析方法，為稀有鮈鯽魚的蛋白質(zhì)分析提供了科學(xué)依據(jù)。

1受試生物：

稀有鮈鯽魚，由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所提供種魚后在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)繁育馴化。實(shí)驗(yàn)魚體長(zhǎng)為2.5cm～3.0cm。

2實(shí)驗(yàn)步驟

2.1蛋白提取及定量

2.1.1蛋白提?。簩⑸齿锾崛∥镏糜?kDa的超濾管中，14000g，離心20min，然后加入400μl水化液，14000g，離心20min，重復(fù)三次（充分置換沙蒿提取物中的PBS），然后將超濾管倒置于新的收集管中，5000g，離心5min，收集樣本。

2.1.2蛋白濃度：測(cè)定提取的蛋白濃度，用于雙向電泳。根據(jù)曲線公式計(jì)算各樣品蛋白濃度。

2.2等電聚焦

2.2.1取150μg蛋白樣品，用樣品水化液將其充分混合，調(diào)整總體積為150μL。

2.2.2從冰箱中取出低溫保存的IPG膠條（7cm，pH=3-10），在室溫下放置10分鐘。

2.2.3在聚焦槽中緩慢加入蛋白樣品。

2.2.4去除IPG膠條的保護(hù)膜，分清膠條的正負(fù)極，將膠條膠面朝下緩慢放置在聚焦漕中。

2.2.5在每根膠條的支持膜面緩慢加上2ml覆蓋油，防止等電聚焦過程中蛋白溶液的蒸發(fā)。

2.2.6準(zhǔn)備完畢后開始等電聚焦程序。

2.3膠條平衡及SDS-PAGE電泳

2.3.1將膠條放入含10ml平衡緩沖液1的平衡管中，室溫緩慢水平搖晃15min，然后再將膠條轉(zhuǎn)移至含10ml平衡緩沖液2的平衡管中緩慢水平搖晃15min。

2.3.2將平衡好的膠條放到第二向SDS-PAGE凝膠的上表面，使膠條與SDS-PAGE凝膠的膠面充分接觸。

2.3.3將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠轉(zhuǎn)印。

2.4凝膠轉(zhuǎn)印

2.5免疫檢測(cè)

2.5.1用TBST液將封閉的膜漂洗2-3次。

2.5.2用蒸餾水將加樣槽清洗干凈，晾干，用一次性手套將膜覆蓋好，按標(biāo)記和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求切下膜條（一般為3 mm寬左右）并按順序放入到加樣槽中。加入約1ml一抗。

2.5.3室溫下?lián)u床孵育2h。

2.5.4棄去一抗，膜條仍置于加樣槽中，每個(gè)槽再加2-3 ml TBST。上搖床洗滌5-10min后換液，反復(fù)4次。

2.5.5用含0.5%脫脂奶粉的TBST按1：5000稀釋酶標(biāo)二抗，再在每個(gè)加樣槽中加入20ml左右二抗，室溫下?lián)u床孵育1h。

2.5.6棄去二抗，膜仍置于加樣槽，每個(gè)槽再加2-3 ml TBST，上搖床洗滌5-10min后換液，反復(fù)4次。

2.5.7化學(xué)發(fā)光

將膜貼在玻璃紙上，加入底物，做化學(xué)發(fā)光。

2.6凝膠掃描及圖像分析

膠片應(yīng)用ImageScanner 掃描儀進(jìn)行掃描，掃描模式為灰度模式，光密度值為300dpi。

使用PDquest 8.0 軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，主要操作包括膠片蛋白點(diǎn)檢測(cè)、圖像背景扣除、蛋白點(diǎn)灰度值標(biāo)準(zhǔn)化、不同膠片間蛋白點(diǎn)匹配。

3結(jié)果

3.1蛋白濃度結(jié)果

結(jié)果顯示，蛋白濃度為16.45 ug/uL。

樣品編號(hào) A060

蛋白濃度（ug/uL） 16.45

3.2全蛋白電泳分析結(jié)果

結(jié)果顯示，樣本中的蛋白種類豐富，且條帶清晰，說(shuō)明蛋白沒有降解，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

3.3等電點(diǎn)分析結(jié)果

結(jié)果顯示，樣本里面HSP 70有兩種等電點(diǎn)，約5和7左右，且片段大小主要位于50-100之間。

4討論

HSP70被認(rèn)為是最保守的蛋白，人的HSP70和細(xì)菌同源蛋白DnaK的序列同源性可達(dá)50%。HSP70家族有多個(gè)成員，有些存在于特定的細(xì)胞器中，有些在特定組織中表達(dá)，總體來(lái)說(shuō)，很多亞型在細(xì)胞中的生物功能是重疊的。稀有鮈鯽熱休克蛋白HSP70多態(tài)性分析方面的研究尚未見公開報(bào)道。本研究建立了稀有鮈鯽魚熱休克蛋白HSP70多態(tài)性分析方法。本研究結(jié)果顯示，樣本里面HSP 70有兩種等電點(diǎn)，約5和7左右，且片段大小主要位于50-100之間。本研究獲得了非常有價(jià)值的稀有鮈鯽魚的熱休克蛋白HSP70多態(tài)性分析結(jié)果，為構(gòu)建稀有鮈鯽魚的蛋白質(zhì)分析提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]劉宗亮，張仁梅，孟慶國(guó).以熱休克蛋白HSP70為靶點(diǎn)的藥物研究進(jìn)展.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào). 2017（4）：416-424

[2]王劍偉，曹文宣. 中國(guó)本土魚類模式生物稀有晌鯽研究應(yīng)用的歷史與現(xiàn)狀. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào). 2017，12（2）：20-3