劉羽 劉檢 易亞喬 凌佳 劉麗 邵樂 劉林

摘要：目的? 觀察百事樂加味方對(duì)卒中后抑郁（PSD）大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、形態(tài)學(xué)改變及海馬自噬蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ表達(dá)的影響，探討PSD神經(jīng)元細(xì)胞自噬機(jī)制及中藥防治作用。方法 ?采用大腦中動(dòng)脈栓塞+慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激+孤養(yǎng)法制作PSD模型，分組前進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，隨機(jī)分為假手術(shù)組、抑郁組、卒中組、PSD組、陽性藥組、百事樂加味方組，各給藥組給予相應(yīng)藥物，連續(xù)28 d。HE、Nissl染色觀察大鼠海馬形態(tài);免疫組化檢測PSD大鼠海馬mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ的表達(dá)。結(jié)果? 與假手術(shù)組比較，PSD組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高，海馬mTOR表達(dá)明顯降低，Beclin-1、LC-3Ⅱ表達(dá)明顯升高（P<0.01）;與PSD組比較，百事樂加味方組大鼠功能缺損評(píng)分顯著降低，海馬組織病理形態(tài)明顯改善，海馬mTOR蛋白表達(dá)明顯升高，Beclin-1、LC-3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 ?百事樂加味方可有效改善PSD大鼠行為學(xué)、病理學(xué)表現(xiàn)，抑制神經(jīng)細(xì)胞異常自噬可能是其抗PSD的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：百事樂加味方;卒中后抑郁;海馬;自噬;腦缺血;大鼠

中圖分類號(hào)：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）02-0052-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.012

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of modified Baishile Formula on the neurological deficit score and the expressions of mTOR， Beclin-1 and LC-3Ⅱ in hippocampus of post-stroke depression （PSD） rats; To explore the preventive and therapeutic mechanism of TCM for post-stroke depression from neuronal autophagy. Methods The rat model of focal cerebral ischemia was established by the method of middle cerebral artery occlusion （MCAO）， and the PSD model was established by combining with chronic unpredictable mild stress （CUMS） and solitary nourishment. The behavioral scores were evaluated by Longa grading method before dividing the groups. The rats were randomly divided into sham-operation group， depression group， post-stroke group， PSD group， positive medicine group and modified Baishile Formula group. Each administration group was given relevant medicine for 28 d. The morphological changes of hippocampus were observed by HE staining and Nissl staining. Immunohistochemical method was used to detect the expressions of mTOR， Beclin-1 and LC-3Ⅱ in hippocampus of PSD rats. Results Compared with the sham-operation group， the neurological deficit score of the PSD group significantly increased， the expression of mTOR in the hippocampus significantly decreased， and the expressions of Beclin-1 and LC-3Ⅱ significantly increased （P<0.01）. Compared with the PSD group， the neurological deficit score of the rats in modified Baishile Formula groupsignificantly decreased， the pathological morphology of the hippocampus wassignificantly improved， the expression of mTOR protein in the hippocampus significantly increased， and the expression of Beclin-1 and LC-3Ⅱ proteins significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Modified Baishile Formula can effectively improve the behavioral and pathological symptoms of PSD rats and inhibit autonomic phagocytosis. It may be one of the important mechanisms of treating PSD.

Keywords： modified Baishile Formula; post-stroke depression; hippocampus; autophagy; cerebral ischemia; rats

自噬是機(jī)體在缺血、缺氧等狀態(tài)下發(fā)生的一種應(yīng)激反應(yīng)，在腦血管、神經(jīng)功能疾病中占有至關(guān)重要的地位，是防治卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）的潛在機(jī)制之一。百事樂加味方是“百事樂”（專利號(hào)ZL20101010856.X）為基礎(chǔ)加味而成，具有活血疏肝、解郁通絡(luò)、養(yǎng)心安神、健脾化痰功效，臨床常用于肝氣郁結(jié)、痰瘀阻絡(luò)證患者，其有抗PSD及改善神經(jīng)功能作用^[1-2]，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。因此，本研究采用形態(tài)學(xué)和免疫組化方法觀察百事樂加味方對(duì)PSD大鼠海馬病理形態(tài)改變和自噬蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ表達(dá)的影響，從海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬方面探討復(fù)方中藥防治PSD可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 藥物

百事樂加味方（柴胡、姜黃、人參等），飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供;鹽酸氟西汀片，禮來蘇州制藥有限公司，20 mg/片，批號(hào)3435A;阿司匹林片，舒泰神生物制藥股份有限公司，50 mg/片，批號(hào)170803。

1.2? 動(dòng)物

SD大鼠80只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度18～22 ℃、相對(duì)濕度40%～50%，自由攝食飲水。

1.3? 主要試劑與儀器

山羊抗兔/小鼠IgG、DAB顯色液，中杉金橋生物試劑公司;甲苯胺蘭，上海試劑三廠;mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ一抗，Bioss公司;多聚甲醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;水合氯醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。TDZ4-WS離心機(jī)（湖南湘儀），血液混勻儀（北京宏潤達(dá)），AUW2200分析天平（日本島津），BC51顯微鏡（日本奧林巴斯）。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 造模

參照改良Koizumi法^[1]制作局灶性腦缺血大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型。10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉;頸部正中切口，鈍性分離右頸總動(dòng)脈（CCA）主干、CCA分叉、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）;相繼結(jié)扎CCA主干和ECA近心端，在CCA主干遠(yuǎn)端及ICA根部穿線備用;用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA遠(yuǎn)端;在距CCA分叉部3～4 mm處用眼科剪剪一小口，插入線栓，使線栓從CCA順行進(jìn)入ICA，松開ICA的微動(dòng)脈夾，使線栓略呈弧形，向外上方的角度緩慢順著ICA走向插入，防止誤插入翼腭動(dòng)脈（PPA）。若只插進(jìn)約10 mm就有明顯阻力則提示誤插，此時(shí)可緩慢退出后調(diào)整方向再插，直到阻力感較明顯時(shí)停止插入，此時(shí)插入深度為18～20 mm（從CCA分叉處計(jì)算），說明線栓到達(dá)大腦中動(dòng)脈（MCA）起始段，將阻斷進(jìn)入MCA的血流，引起局灶性腦缺血改變。結(jié)扎CCA主干遠(yuǎn)端及ICA根部備線，防止線栓脫落，剪斷多出的栓線;生理鹽水清洗，消毒棉球清潔手術(shù)野，逐層縫合。注射用青霉素鈉鹽4萬U/只腹腔注射，預(yù)防術(shù)后感染^[2-3]。手術(shù)大鼠單籠孤養(yǎng)，術(shù)后恢復(fù)7 d后，再給予28 d慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激（CUMS），包括禁食、禁水、行為限制、潮濕墊料、晝夜顛倒、傾籠、夾尾7種刺激方法，每種方法使用4次，隨機(jī)分布于4個(gè)應(yīng)激周期中，制作PSD模型。

2.2? 分組

大鼠在預(yù)養(yǎng)期間進(jìn)行蔗糖水消耗訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)行為評(píng)分，測定蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)的基線值，從中篩選出行為評(píng)分均一的大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、抑郁組、卒中組、PSD組、陽性藥組、百事樂加味方組（中藥組）。隨機(jī)補(bǔ)充手術(shù)后死亡的大鼠和應(yīng)激過程及實(shí)驗(yàn)過程中不可預(yù)料因素致死的大鼠，使每組最終達(dá)到8只。假手術(shù)組：給予假手術(shù)處理，除栓線不插入頸總動(dòng)脈外，其余操作同卒中組。采用線栓法制備局灶性腦缺血MCAO模型，選擇術(shù)后神經(jīng)功能缺損評(píng)分>1分且<4分大鼠入組，每籠4只飼養(yǎng);抑郁組：CUMS結(jié)合孤養(yǎng)法制備慢性應(yīng)激抑郁模型;PSD組：MCAO模型大鼠術(shù)后恢復(fù)7 d后加以孤養(yǎng)法結(jié)合CUMS法。

2.3? 給藥

除假手術(shù)組與卒中組外，其余各組大鼠應(yīng)激造模28 d，各組均于應(yīng)激造模同時(shí)給藥，陽性藥組大鼠灌胃給予氟西汀（0.005 4g/kg）+阿司匹林（0.27 g/kg），中藥組大鼠給予百事樂加味方煎液（23.5 g/kg）灌胃，假手術(shù)組、卒中組、抑郁組、PSD組大鼠均灌胃蒸餾水。給藥體積均為10 mL/kg，連續(xù)28 d。

2.4? 指標(biāo)檢測

2.4.1? 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

分別于MCAO造模分組及應(yīng)激后每周按照Longa分級(jí)法^[4]進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分：0分為無缺陷;1分為不能伸展對(duì)側(cè)前肢;2分為對(duì)側(cè)前肢屈曲;3分為輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;4分為嚴(yán)重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;5分為向?qū)?cè)跌倒進(jìn)行。觀察各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分情況。

2.4.2? 海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)觀察

灌胃給藥28 d后，取材前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，腹主動(dòng)脈采血處死，迅速4%多聚甲醛從心臟灌注固定，取大腦海馬組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟與包埋，將蠟塊常規(guī)切片，HE、Nissl染色觀察形態(tài)學(xué)變化。

2.4.3? 海馬自噬相關(guān)蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ檢測

大鼠處死后，4%多聚甲醛固定，取大鼠海馬組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟與包埋，切片，免疫組化檢測大鼠細(xì)胞凋亡因子mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ表達(dá)。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果

與假手術(shù)組比較，PSD組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高（P<0.01）;與PSD組比較，中藥組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低（P<0.01）。

4.2? 百事樂加味方對(duì)模型大鼠海馬病理形態(tài)的影響

海馬組織形態(tài)觀察顯示，PSD組大鼠海馬組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，核固縮，壞死灶邊緣可見炎性細(xì)胞浸潤等不同程度的病理損害;經(jīng)藥物治療后，與PSD組比較，中藥組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、變性、壞死等病理學(xué)改變明顯改善。

4.3? 百事樂加味方對(duì)大鼠海馬組織自噬蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ水平的影響

與假手術(shù)組比較，PSD組大鼠海馬組織mTOR表達(dá)水平明顯低降，Beclin-1、LC-3Ⅱ表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與PSD組比較，中藥組大鼠海馬組織mTOR表達(dá)水平明顯上升，Beclin-1、LC-3Ⅱ表達(dá)水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。

5? 討論

自噬是真核細(xì)胞防御和應(yīng)激調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制，具有兩面性：一方面，在細(xì)胞營養(yǎng)缺乏時(shí)，自噬發(fā)揮維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的重要作用，在發(fā)育過程中有利于組織重塑，清除細(xì)胞內(nèi)有害和過剩的細(xì)胞器及病原體，起保護(hù)作用;另一方面，過度激活可導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，是引起一系列疾病的病理過程。自噬在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用，尤其是對(duì)維持神經(jīng)元的功能起著重要的作用，腦卒中缺血、缺氧、應(yīng)激等狀態(tài)均誘導(dǎo)機(jī)體自噬失衡，加重神經(jīng)組織損傷，自噬調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡是神經(jīng)保護(hù)作用重要機(jī)制。李丹丹等^[5]研究表明，腦缺血引起的缺血、缺氧等應(yīng)激條件可誘導(dǎo)自噬發(fā)生，形成LC3-Ⅱ復(fù)合物，LC3-Ⅱ是自噬形成的標(biāo)記物。徐愛軍等^[6]研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散具有顯著的抗抑郁作用，其主要作用機(jī)制可能與其降低海馬LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值和Beclin-1蛋白水平，抑制神經(jīng)元自噬有關(guān)。

哺乳動(dòng)物mTOR是各種形式突觸重塑和記憶形成所必不可少的關(guān)鍵激酶，是防治抑郁癥新的重要靶點(diǎn)。mTOR是神經(jīng)元細(xì)胞生長、發(fā)育、成熟及功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)的重要蛋白。mTOR通路抗抑郁研究表明，激活mTOR信號(hào)可有利于抑郁癥突觸重塑^[7];PI3K/mTOR/CREB通路活化在大鼠神經(jīng)退化，突觸和神經(jīng)傳遞功能障礙，抗氧化應(yīng)激方面具有保護(hù)作用^[8];藥物可通過PI3K/Akt/mTOR通路上調(diào)皮質(zhì)甾酮誘導(dǎo)小鼠抑郁模型海馬mTOR、PSD95及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)，從而產(chǎn)生抗抑郁作用^[9];或上調(diào)mTOR信號(hào)通路，調(diào)節(jié)海馬突觸重塑并緩解抑郁癥狀^[10]。

mTOR-自噬通路是腦神經(jīng)分子網(wǎng)絡(luò)的一條重要的調(diào)控軸，mTOR-自噬調(diào)控失衡是抑郁癥的主要發(fā)病機(jī)制^[11]。mTOR介導(dǎo)自噬信號(hào)通路調(diào)控神經(jīng)分子網(wǎng)絡(luò)可能是PSD突觸重塑新機(jī)制。已有研究報(bào)道，mTOR/自噬調(diào)控信號(hào)通路在腫瘤、糖尿病、心腦血管等疾病中起重要作用，尤其在腦血管并發(fā)神經(jīng)性疾病^[12-14]。mTOR是調(diào)控自噬的關(guān)鍵信號(hào)分子，mTOR/自噬調(diào)節(jié)平衡是神經(jīng)元細(xì)胞存活、突觸重塑的重要因素。在腦缺血缺氧（腦卒中）損傷及應(yīng)激等狀態(tài)均可以激發(fā)mTOR/自噬信號(hào)調(diào)控的失衡，激活自噬是抑郁癥的主要發(fā)病機(jī)制^[9];在缺血再灌注大鼠模型中，間歇性缺氧激活mTOR/自噬通路，增加細(xì)胞自噬，加重神經(jīng)細(xì)胞損傷^[15]?？挂钟羲幬锓魍∧芡ㄟ^調(diào)節(jié)mTOR-自噬通路激活mTOR，抑制自噬緩解抑郁癥狀，改善抑郁大鼠模型海馬突觸重塑^[10]。有研究報(bào)道，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體參與神經(jīng)元細(xì)胞自噬過程，通過激活誘發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞自噬進(jìn)而凋亡，產(chǎn)生抑郁，抑制NMDA受體可激活mTOR通路，抑制自噬，保護(hù)神經(jīng)元突觸可塑性^[16-17];NMDA通過AKT/mTOR介導(dǎo)自噬在其他疾病研究已有報(bào)道，目前在PSD中尚未見報(bào)道^[18]。

PSD在中醫(yī)里未見明確記載，其屬情志疾病中“郁癥”與“中風(fēng)”之合病，痰瘀互結(jié)為主要致病因素，情志不舒、氣機(jī)郁滯，氣不布津，聚而成痰，痰濕上擾，蒙蔽清竅，元神失用而致PSD。百事樂加味方中姜黃活血化瘀、行氣止痛，善破肝脾二經(jīng)之血瘀氣結(jié)，主血瘀氣滯諸癥，現(xiàn)代藥理研究表明，姜黃有效成分姜黃素可通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬^[19];人參大補(bǔ)元?dú)?、安神益智、解郁化痰，其有效成分人參皂苷Rg1可通過抑制海馬神經(jīng)元異常自噬，從而改善大鼠行為學(xué)和神經(jīng)突觸重塑^[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PSD模型大鼠海馬組織mTOR蛋白表達(dá)下調(diào)、Beclin-1、LC-3Ⅱ表達(dá)上調(diào)，提示自噬異?；罨荘SD病理機(jī)制之一。百事樂加味方干預(yù)治療，能有效降低自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平，抑制異常自噬，改善海馬病理形態(tài)，提高神經(jīng)功能。據(jù)此推測，mTOR介導(dǎo)自噬調(diào)控失衡，相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)分子網(wǎng)絡(luò)功能異常，從而影響海馬突觸重塑障礙可能是PSD的重要機(jī)制。但百事樂加味方在PSD神經(jīng)系統(tǒng)分子網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。

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