阮同德 徐英民 顧傳蘭 許麗娜 王海峰 徐蒙 高敏 馬德亮

【摘要】 目的 分析微小RNA（miR）-34b及c-Myc在膀胱癌中的作用， 并驗(yàn)證兩者相互作用關(guān)系。方法 107例膀胱癌患者， 全部患者均行手術(shù)治療， 取病理組織及瘤旁組織樣本， 比較miR-34b及c-Myc在膀胱癌和瘤旁組織、肌層浸潤(rùn)和肌層非浸潤(rùn)及的各病理分級(jí)的表達(dá)水平， 采用熒光素酶法及生物信息學(xué)軟件分析miR-34b與c-Myc的相互作用關(guān)系。結(jié)果 miR-34b在膀胱癌中的相對(duì)表達(dá)水平為（0.0213±0.0061）， 與瘤旁組織的（0.0563±0.0089）對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;c-Myc在膀胱癌中的相對(duì)表達(dá)水平為（0.484±0.063）， 與瘤旁組織的（0.216±0.045）對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。miR-34b在45例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的相對(duì)表達(dá)水平為（0.0234±0.0026）， 與62例肌層非浸潤(rùn)性膀胱癌中的（0.0496±0.0075）對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;c-Myc在45例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的相對(duì)表達(dá)水平為（0.5180±0.0826）， 與62例肌層非浸潤(rùn)性膀胱癌中的（0.3140±0.0753）對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。miR-34b在低度惡性?xún)A向、低分級(jí)、高分級(jí)病例的表達(dá)水平依次為（0.0364±0.0047）、（0.0219±0.0034）和（0.0102±0.0028）， 其表達(dá)水平隨病理分級(jí)升高呈現(xiàn)降低趨勢(shì)， 組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=386.732， P<0.05）;c-Myc在低度惡性?xún)A向、低分級(jí)、高分級(jí)病例的表達(dá)水平依次為（0.083±0.013）、（0.236±0.032）和（0.571±0.058）， 其表達(dá)水平隨病理分級(jí)升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)， 組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=106.964， P<0.05）。經(jīng)生物信息學(xué)軟件檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， c-Myc是miR-34b的直接靶基因， 采用熒光素酶法進(jìn)一步檢測(cè)后證實(shí)， 共轉(zhuǎn)染miR-34b的熒光強(qiáng)度（1.035±0.024）au明顯低于共轉(zhuǎn)染的c-Myc強(qiáng)度（3.572±0.068）au （P<0.05）。結(jié)論 c-Myc是miR-34b的直接靶基因， 二者存在密切的相關(guān)性， 可通過(guò)下調(diào)c-Myc水平提升miR-34b表達(dá)， 抑制膀胱細(xì)胞癌增殖。

【關(guān)鍵詞】 微小RNA-34b;c-Myc;膀胱癌;作用

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.04.007

臨床研究證實(shí)， miR-34b在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用， 在胃癌、肝癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤組織中存在多項(xiàng)miRNA表達(dá)異常情況， 而膀胱癌發(fā)展與多種癌基因、抑癌基因的相互作用存在密切相關(guān)性[1-3]。目前醫(yī)學(xué)界尚未就miR-34b與c-Myc的表達(dá)及作用關(guān)系達(dá)成統(tǒng)一共識(shí)， 為了探索二者的聯(lián)系， 本文現(xiàn)就miR-34b及c-Myc在膀胱癌中的作用及驗(yàn)證兩者相互作用關(guān)系展開(kāi)了下述研究， 以供參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2014年3月～2018年3月收治的107例膀胱癌患者， 全部患者均行手術(shù)治療， 取病理組織及瘤旁組織樣本作為研究對(duì)象， 全部實(shí)驗(yàn)用品均在有效期內(nèi)。

1. 2 方法 采用實(shí)時(shí)定量PCR提取樣本總RNA， 根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明將其轉(zhuǎn)錄呈cDNA模板， 利用探針?lè)z測(cè)器miR-34b表達(dá)， 內(nèi)參U6。采用SYBR Green法測(cè)定c-Myc表達(dá)， 上游引物序列為5'-GCATCCGCACACTCGCACGAA-3';下游引物序列為5'-CGACAGTCCATCGATCGCCTAGC-3'， 運(yùn)用2-△△CT相對(duì)定量法對(duì)比基因表達(dá)。利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行作用于c-Myc的靶向miRNA預(yù)測(cè)， 軟件包括PicTar、miRanda、TargetScan。采用熒光素酶試劑盒處理細(xì)胞組織， 利用實(shí)施熒光定量?jī)x測(cè)定miR-34b轉(zhuǎn)染狀態(tài)。

1. 3 觀察指標(biāo) 比較miR-34b及c-Myc在膀胱癌和瘤旁組織、肌層浸潤(rùn)和非肌層浸潤(rùn)及的各病理分級(jí)的表達(dá)水平， 分析miR-34b與c-Myc的相互作用關(guān)系。所有患者中肌層浸潤(rùn)性患者45例， 肌層非浸潤(rùn)性患者62例。根據(jù)WHO 2004標(biāo)準(zhǔn)[2]將107例病理切邊標(biāo)本分為三組， 包括低度惡性?xún)A向患者24例， 低分級(jí)患者48例， 高分級(jí)患者35例。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性檢驗(yàn)采用應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 miR-34b及c-Myc在不同組織、肌層浸潤(rùn)、病理分級(jí)的表達(dá)水平對(duì)比 ①miR-34b及c-Myc在膀胱癌和瘤旁組織的表達(dá)水平：miR-34b在膀胱癌中的相對(duì)表達(dá)水平為（0.0213±0.0061）， 在瘤旁組織的表達(dá)水平為（0.0563±0.0089）， 組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.554， P=0.000<0.05）;c-Myc在膀胱癌中的相對(duì)表達(dá)水平為（0.484±0.063）， 在瘤旁組織的表達(dá)水平為（0.216±0.045）， 組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=35.807， P=0.030<0.05）。②肌層浸潤(rùn)和非肌層浸潤(rùn)中miR-34b及c-Myc的表達(dá)水平：miR-34b在45例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的相對(duì)表達(dá)水平為（0.0234±0.0026）， 在62例肌層非浸潤(rùn)性膀胱癌中的相對(duì)表達(dá)水平為（0.0496±0.0075）， 組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.451， P=0.000）;c-Myc在45例肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的相對(duì)表達(dá)水平為（0.5180±0.0826）， 在62例肌層非浸潤(rùn)性膀胱癌中的相對(duì)表達(dá)水平為（0.3140±0.0753）， 組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.280， P=0.000<0.05）。③不同病理分級(jí)下miR-34b及c-Myc表達(dá)水平的變化情況：miR-34b在低度惡性?xún)A向、低分級(jí)、高分級(jí)患者中的表達(dá)水平依次為（0.0364±0.0047）、（0.0219±0.0034）和（0.0102±0.0028）， 其表達(dá)水平隨病理分級(jí)升高呈現(xiàn)降低趨勢(shì)， 組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=386.732， P<0.05）;c-Myc在低度惡性?xún)A向、低分級(jí)、高分級(jí)患者中的表達(dá)水平依次為（0.083±0.013）、（0.236±0.032）和（0.571±0.058）， 其表達(dá)水平隨病理分級(jí)升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)， 組間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=106.964， P<0.05）。

2. 2 miR-34b與c-Myc的相互作用關(guān)系 經(jīng)生物信息學(xué)軟件檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， c-Myc是miR-34b的直接靶基因， 采用熒光素酶法進(jìn)一步檢測(cè)后證實(shí)， 共轉(zhuǎn)染miR-34b的熒光強(qiáng)度（1.035±0.024）au明顯低于共轉(zhuǎn)染的c-Myc強(qiáng)度（3.572±0.068）au（P<0.05）， miR-34b可對(duì)c-Myc產(chǎn)生直接作用。

3 討論

國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道顯示， miR-34b及c-Myc表達(dá)水平與腫瘤病理分級(jí)、腫瘤分類(lèi)密切相關(guān)， 大量研究資料顯示， 膀胱癌組織細(xì)胞中c-Myc呈現(xiàn)活化狀態(tài)， 且隨腫瘤病理分級(jí)的升高、病情的加劇呈現(xiàn)升高態(tài)勢(shì)。本研究證實(shí)， c-Myc在膀胱癌的表達(dá)水平明顯高于瘤旁組織， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)過(guò)深入探討miR-34b及c-Myc在膀胱癌中的作用后發(fā)現(xiàn)， miR-34b在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的表達(dá)水平為明顯低于肌層非浸潤(rùn)性膀胱癌組織， 而c-Myc在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的表達(dá)水平為明顯高于肌層非浸潤(rùn)性膀胱癌組織， 這與既往研究一致。

整理相關(guān)文獻(xiàn)資料后可知， c-Myc在腫瘤細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、增殖及凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用， 與腫瘤生物學(xué)行為存在緊密聯(lián)系。本組實(shí)踐證實(shí)， 膀胱癌組織細(xì)胞的miR-34b的表達(dá)水平隨病理分級(jí)升高呈現(xiàn)降低趨勢(shì)， c-Myc的表達(dá)水平隨病理分級(jí)升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)， 提示c-Myc與膀胱癌惡性程度關(guān)聯(lián)密切。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)、熒光素酶檢驗(yàn)后證實(shí)， c-Myc是miR-34b的直接靶基因， 共轉(zhuǎn)染miR-34b的熒光強(qiáng)度明顯低于共轉(zhuǎn)染的c-Myc強(qiáng)度， 表明可通過(guò)下調(diào)c-Myc水平影響癌細(xì)胞生物行為， 防控病情進(jìn)展。

綜上所述， c-Myc是miR-34b的直接靶基因， 通過(guò)下調(diào)c-Myc表達(dá)可促使miR-34b表達(dá)得到有效提升， 加快癌細(xì)胞凋敝， 抑制癌細(xì)胞增殖， 對(duì)膀胱癌的臨床診療具有重要的參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] 柳清， 尤泊森， 馬景光， 等. MicroRNA-30a在膀胱癌中的表達(dá)及作用. 實(shí)用腫瘤學(xué)雜志， 2017（4）：310-315.

[2] 郭敏， 劉佩， 鄭國(guó)華， 等. p53/miR-34a通路介導(dǎo)羽扇豆醇的抑制人膀胱癌T24細(xì)胞增殖作用. 中國(guó)藥師， 2016， 19（9）：1629-1632.

[3] 萬(wàn)鵬飛， 黃亞琴， 王志， 等. 穩(wěn)定高表達(dá)miR-449c的5637膀胱癌細(xì)胞株的建立. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志， 2016， 32（6）：760-763.

[收稿日期：2018-08-14]